GENETICA MOLECOLARE, EPIDEMIOLOGIA, PATOGENESI DEL RENE MIDOLLARE A SPUGNA

IL Rene con Midollare a Spugna (MSK) riconosciuto per la prima volta a Padova, da Lenarduzzi nel 1939 grazie all’impiego dell’allora nuova tecnica dell’urografia e successivamente descritto nel 1949 da Cacchi e Ricci, rispettivamente urologo e patologo dell’Università patavina può essere annoverato tra le nefropatie congenite malformative per la presenza di ectasie precaliceali dei dotti collettori e per la sua frequente associazione con altre malformazioni congenite renali ed extrarenali. La funzione renale e la durata della vita nei pazienti MSK è normale; spesso si complica con lo sviluppo di nefrocalcinosi e nefrolitiasi. La patogenesi di MSK non è stata completamente chiarita ma la maggior parte degli autori concorda che si tratta di una patologia congenita con espressione ritardata. Che la causa di MSK potesse essere di natura genetica era suggerito dalla descrizione di alcuni casi familiari, dall’appartenenza di MSK al gruppo delle patologie malformative e dalla sua associazione con altre malattie ereditarie. La scoperta del gene/i responsabili della patologia è stato negli ultimi anni obiettivo del nostro gruppo di lavoro ed in particolare del mio lavoro di dottorato. L’ipotesi che ha dato inizio allo studio è che MSK sia la conseguenza di un disturbo durante lo sviluppo renale dell’interfaccia “gemma ureterale- mesenchima metanefrico” a causa di mutazioni/polimorfismi di RET, GDNF, o di altri geni coinvolti nell’embriogenesi renale, o in particolare a causa dell’interazione GDNF/RET. I risultati del sequenziamento diretto e test RFLP di GDNF su una casistica veneta di 112 pazienti, ben selezionata sulla base di stretti criteri urografici hanno permesso di identificare 1 variante rara della regione del promotore di GDNF (-27+18G>A) significativamente associata a MSK (p=0.02). Inoltre, la possibilità di estendere lo screening di GDNF su alcuni familiari di pazienti MSK ci ha permesso di scoprire che le varianti erano ereditate e che nelle famiglie erano associate al fenotipo MSK. Nella seconda parte del lavoro di dottorato è stata posta l’attenzione sui casi familiari di MSK. In collaborazione con la Clinica Nefrologica di Verona sono stati indagati 50 gruppi famigliari scelti random dalla coorte di 112 pazienti con MSK . Dall’’analisi mediante ecografia e/o Uro-TC estesa ai consanguinei della stessa generazione, e di 1, se possibile, 2 generazioni precedenti e/o successive è emerso che in 27 famiglie MSK segregava come carattere autosomico dominante, con espressività variabile e ridotta penetranza. Sui probandi di queste famiglie è stato fatto lo screening per il gene GDNF. Inoltre, in collaborazione con il laboratorio di Nefrologia Pediatrica dell’Università di Padova è stato fatto, lo screening di Six1, Spry1 e Pax2 che sono geni coinvolti nel processo di nefrogenesi renale e con un importante ruolo nei meccanismi di regolazione di GDNF, per un totale di 19 casi famigliari. Lo screening di GDNF mediante sequenziamento diretto delle regioni esoniche e delle giunzioni introne-esone non ha evidenziato nessuna variante rare né altre sostituzioni nucleotidiche. Allo stesso modo nessuna mutazione causativa è stata evidenziata per Six1, Spry1 e Pax2. Per Spry1 e Pax2 solo polimorfismi noti ma senza alcuna significatività statistica nelle frequenze alleliche confrontata con quella di popolazioni di controllo riportate in letteratura. Un altro obiettivo del mio lavoro di dottorato è stato quello di aver cercato di capire come varianti rare di GDNF possano essere associate al fenotipo MSK, in un sottogruppo di pazienti con nefrolitiasi, nefrocalcinosi ed MSK bilaterale. L’asportazione di un carcinoma renale in una paziente con MSK e mutazione di GDNF (-27+18G/C) ha dato l’opportunità di studiare per la mutazione di GDNF il suo significato funzionale e di verificare che cellule papillari renale prelevate da polo indenne al carcinoma renale e con bassi profili di espressione per GDNF, differenziavano spontaneamente verso un lineaggio osteogenico con la sintesi di proteine tipiche della matrice osteoide. Per cercare di approfondire se la down regolazione di GDNF, molto probabilmente dovuta alla mutazione che cade nella regione del promotore, possa avere avuto un coinvolgimento nel fenomeno di calcificazione osservato si è cercato di ottenere su cellule epiteliali renali (HK2), attraverso la tecnica di RNA interference, un silenziamento stabile di GDNF. I dati preliminari di questi ultimi esperimenti hanno mostrato che nelle cellule HK2 silenziate per GDNF vi era la presenza di depositi di Ca2PO4, confermati sia dalla colorazione von Kossa sia dall’analisi SEM. la presenza dei depositi di calcio fosfato non sono state osservate né nel controllo negativo né nei cloni silenziati in normali condizioni di coltura, mentre nel controllo negativo in condizione osteogenica i depositi erano presenti, seppur in minore quantità rispetto al clone silenziato. Sebbene preliminari, i nostri suggeriscono che la down regolazione di GDNF potrebbe favorire la deposizione di Ca2PO4 attraverso un meccanismo non ancora identificato. La nostra ipotesi è che l’apoptosi potrebbe essere la chiave.