Unraveling the mechanisms of alpha-synuclein aggregation and toxicity

La malattina di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerative più comune dopo il morbo di Alzheimer e colpisce circa l’1% delle popolazione sopra i 65 anni di età. Questa malattia può essere sia sporadica che familiare e alcune forme genetiche sono dovute a mutazioni nel gene SNCA che codifica per la proteina alfa-sinucleina. Le caratteristiche patologiche principali della malattia di Parkinson sono la morte prevalentemente dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta e la presentza di inclusioni proteiche e lipidiche, dette corpi di Lewy, nei neuroni che sopravvivono nei cervelli dei pazienti affetti dalla malattia. Il componente principale dei corpi di Lewy è una forma di alfa-sinucleina aggregata, fibrillare e ricca di foglietti beta. Il processo di aggregazione di alfa-sinucleina è stato ampiamente studiato negli anni passati: la proteina è non strutturata nella sua forma nativa, ma in condizioni patologiche tende ad aggregare formando specie oligomeriche. Questi oligomeri costituiscono un insieme etereogeneo e transiente e si convertono rapidamente in fibrille amiloidi quando raggiungono una concentrazione critica. Le fibrille amiloidi di alfa-sinucleina si depositano poi nei corpi di Lewy assieme ad altre proteine e lipidi. L’aggregazione di alfa-sinucleina è stata principalmente studiata in vitro, anche se più recentemente maggiori sforzi sono stati effettuati per caratterizzare il processo in modelli cellulari ed animali, per identificare non soltanto i diversi prodotti dell’aggregazione, ma anche i meccanismi tossici ad essi associati, che causano la morte dei neuroni nei pazienti affetti dalla malattia di Parkinson. In questa tesi due questioni principali sono state affrontate: lo studio dell’aggregazione di alfa-sinucleina in cellule utilizzando metodi non convenzionali di microscopia in fluorescenza e la caratterizzazione degli effetti di una famiglia di proteine chaperoniche, le 14-3-3, sul processo di aggregazione. Nella prima parte, due modelli cellulari per lo studio dell’aggregazione di alfa-sinucleina sono stati approntati e caratterizzati: il primo viene ottenuto sovraesprimento soltanto alfa-sinucleina e ha permesso la caratterizzazione di un ensemble di oligomeri eterogenei in cellule vive (circa 6±4 monomeri per oligomero) utilizzando un nuovo metodo di microscopia in fluorescenza chiamato Number and Brightness analysis. Queste specie oligomeriche inducono l’attivazione del sistema autofagico-lisosomiale e la frammentazione dei mitocondri in questo modello cellulare. Il secondo modello cellulare fornisce un metodo per lo studio delle fibrille di alfa-sinucleina e di aggregati più grandi in un ambiente di rilevanza fisiologica: alfa-sinucleina è stata sovrespressa in cellule e l’aggregazione è stata promossa introducendo nel citoplasma delle cellule frammenti di fibrille ottenute da alfa-sinucleina ricombinante, detti seeds. In entrambi i casi la sovraespressione e l’aggregazione di alfa-sinucleina hanno causato morte cellulare, in buon accordo con quello che è stato riportato in precedenza da altri gruppi di ricerca. La caratterizzazione dell’aggregazione di alfa-sinucleina in cellule è continuata osservando la variazione nel metabolismo cellulare, potenzialmente indotta da danni ai mitocondri. Queste variazione sono state quantificate misurando le proprietà della fluorescenza del NADH nei due modelli, rispetto al controllo. Questi risultati hanno mostrato che in cellule che presentano oligomeri o aggregati di alfa-sinucleina, il tempo di vita della fluorescenza del NADH e il suo spettro di emissione cambiano. Quindi, queste misure potrebbero essere ottimizzare per rilevare la presenza di aggregati di alfa-sinucleina in cellule e in vivo, utilizzando un metodo di indagine non invasivo e dye-free. La seconda parte della tesi riguarda l’abilità delle proteine chaperoniche 14-3-3 di interagire con alfa-sinucleina e di interferire con il suo processo di aggregazione, riducendone la tossicità in cellule. Tra le sette isoforme della famiglia di 14-3-3, la 14-3-3 eta può revertire il processo di fibrillazione di alfa-sinucleina in vitro, portando alla formazione di oggetti curvi invece che di fibrille canoniche. Questi oggetti curvi hanno diametri e curvature che dipendono dalla quantità di 14-3-3 eta nel saggio di aggregazione: inoltre, molecole di 14-3-3 eta sono state trovate in questi aggregati, suggerendo la formazione di un complesso stabile costituito dalle due proteine. Quanto la quantità di alfa-sinucleina è troppo grande o i seeds vengono utilizzati per promuovere il processo di aggregazione in vitro, la 14-3-3 eta non è più in grado di interferire con il processo di aggregazione di alfa-sinucleina e viene sequestrata nelle fibrille. Nei modelli cellulari, la sovraespressione di 14-3-3 eta riduce la tossicità indotta da alfa-sinucleina quando quest’ultima è soltato sovraespressa e oligomerizza, ma non quando l’aggregazione in cellule viene promossa dai seeds. È stato mostrato, utilizzando tecniche di image correlation spectroscopy (cross raster image correlation spectroscopy e cross Number and Brightness analysis) che la 14-3-3 eta sovraespressa può interagire con alfa-sinucleina sovraespressa, principalmente alla membrana plasmatica. Inoltre, la 14-3-3 eta viene sequestrata negli aggregati quando il processo di aggregazione di alfa-sinucleina è indotto dai seeds, evidenziando un altro possibile meccanismo di tossicità dovuto all’aggregazione. Tutti i risultati ottenuti in cellule sono in buon accordo con i risultati ottenuti in vitro e precedentemente riportati; questo rafforza ulteriormente l’idea che le proteine 14-3-3 e in particolare l’isoforma eta siano particolarmente interessanti nel contesto dello studio dell’aggregazione di alfa-sinucleina e che potrebbero essere utilizzare per interferire con il processo di aggregazione e ridurne gli effetti tossici.