Morphological and Biochemical Characterization of Bovine Congenital Psudomyotonia

La Ca2+-ATPasi del reticolo sarco(endo)plasmatico (SERCA) è una proteina di circa 110 kDa membro della famiglia delle P-type ATPasi. Le SERCA utilizzano l'energia ricavata dall’idrolisi di una molecola di ATP per trasportare due ioni Ca2+ attraverso la membrana del reticolo sarcoplasmatico (SR) e diminuire così la concentrazione di Ca2+ nel citosol. La SERCA1a è l'isoforma espressa prevalentemente dalle fibre muscolari fast nell’adulto ed è strutturalmente e funzionalmente la meglio caratterizzata tra tutte le ATPasi. Un disturbo muscolare ereditario definito come Pseudomiotonia Congenita Bovina (PMT) è stato recentemente descritto in due importanti razze bovine da carne italiane Chianina e Romagnola (RMG) e, come caso isolato, in un incrocio olandese (Dutch improved Red&White -VRB-). La malattia è caratterizzata clinicamente da una contrazione muscolare indotta da esercizio ma non associata ad alterazioni elettromiografiche. La causa attribuita al ritardato rilassamento muscolare è stata una prolungata permanenza del Ca2+ nel citoplasma. Poiché la struttura primariamente coinvolta nel re-uptake del Ca2+ all’interno del SR dopo la contrazione muscolare è la pompa ATPasi, è stato proposto un coinvolgimento della proteine SERCA1a. Il sequenziamento del DNA di animali affetti ha dimostrato la presenza di mutazioni nel gene ATP2A1 che codifica appunto la SERCA1. Ad oggi diverse mutazioni puntiformi sono state descritte nelle varie razze che manifestano la malattia. La PMT è stato caratterizzata a livello genetico e biochimico nella razza Chianina. L'obiettivo principale di questo progetto è quello di completare la caratterizzazione della malattia attraverso l’analisi morfologica, istochimica e biochimica dei casi di PMT descritti nelle razze RMG e VRB. Scopo ultimo è quello di aumentare le conoscenze sugli effetti morfologici e biochimici della malattia sul tessuto muscolare, valutare la variabilità fenotipica della malattia e individuare eventuali meccanismi di adattamento o compensatori che potrebbero suggerire nuovi approcci terapeutici alle ricerche future. L'interesse per la PMT deriva dalla sua stretta somiglianza con una rara disfunzione muscolare ereditaria dell’uomo chiamata malattia di Brody. Il bovino di razza Chianina affetto da PMT è stato di fatto accettato come un interessante e utile modello animale non convenzionale per lo studio di questa condizione patologica umana. L’esame istopatologico delle biopsie muscolari ottenute dai soggetti RMG e VRB non hanno mostrato alterazioni particolarmente severe. Sono state individuate alcune fibre in degenerazione sempre accompagnate da fenomeni di rigenerazione (piccole fibre positive per la MHC neonatale). I protocolli istochimici (COX-SDH e PAS) non hanno evidenziato alterazioni metaboliche o cambiamenti nella distribuzione del glicogeno. Le indagini immunoistochimiche sull'espressione SERCA1 hanno mostrato una diminuita immunoreattività nei casi patologici suggerendo una minore presenza della proteina. Le analisi biochimiche effettuate sulle frazioni microsomiali hanno confermato la sola riduzione in contenuto di SERCA1, mentre né il RyR (marker del SR giunzionale) né SL e GP53 (marker del SR non-giunzionale) hanno mostrato alcuna variazione. Saggi di attività per la Ca2+ -ATPasi hanno associato una minore attività della proteina alla diminuzione quantitativa della stessa, mentre la Real Time RT-PCR ha dimostrato che l’mRNA della SERCA1 è espresso normalmente suggerendo che la riduzione della proteina avviene post-trascrizione. Un’interessante osservazione è stata che le sezioni del soggetto VRB mostravano una maggiore e più omogenea colorazione per COX e SDH suggerendo un aumento in contenuto di mitocondri. Quest'ultimo risultato è stato rafforzato da indagini di immunoistochimica e immunoblot utilizzando un anticorpo contro una proteina della membrana mitocondriale esterna (Tom20). Inoltre, frazioni microsomiali ottenute dal soggetto VRB hanno mostrato un aumento in contenuto della Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica (PMCA). Infine, alcune fibre dei soggetti analizzati in questo studio hanno mostrato immunoreattività per SERCA1 e fosfolambano (PLB, proteina regolatrice della SERCA2) o per entrambe le isoforme 1 e 2 suggerendo un'alterazione nel classico pattern di espressione esclusivo delle tre proteine. I risultati di questa ricerca descrivono la Pseudomyotonia Congenita Bovina nei soggetti RGM e VRB come una malattia muscolare caratterizzata da alterazioni istopatologiche lievi e una diminuzione del contenuto e dell'attività della SERCA1, sovrapponibile al quadro descritto nella Chianina. Le analisi effettuate su VRB e RGM hanno permesso di ottenere un’immagine dettagliata della PMT in queste razze e, insieme ai dati sulla Chianina, ha permesso di definire un quadro istopatologico e biochimico generale della PMT. Inoltre, per la prima volta sono stati dimostrati meccanismi compensatori fornendo prove istochimiche e biochimiche a sostegno di un coinvolgimento dei mitocondri e della PMCA nell’omeostasi del Ca2+ in situazioni patologiche come la PMT. Infine, il ritrovamento di fibre che co-esprimevano SERCA1, SERCA2 e PLB è stato un risultato collaterale interessante che suggerisce una elevata plasticità del muscolo bovino che lo avvicina ancora una volta al muscolo umano. Un progetto parallelo è stato sviluppato in collaborazione con il gruppo del Prof. R. Smith e del Dr. J. Dudhia del Clinical Sciences and Services Department of the Royal Veterinary College (London). Due diversi studi pilota sono stati effettuati per valutare la risposta della matrice extracellulare alla lesione tendinea nel cavallo. Il primo ha avuto come oggetto di studio la cartilage oligomeric matrix protein (COMP), recentemente proposta come biomarker di tendinopatia. Lo scopo di questo progetto è stato quello di valutare il livello di frammentazione (indice di alterazione, ma anche rimodellamento) di COMP nel tessuto tendineo sano raccolti in siti noti per essere più frequentemente coinvolti nelle lesioni (predisposti a lesione). I tendini analizzati sono stati il flessore digitale superficiale (SDFT) e il flessore digitale profondo (DDFT). L’immunoblot e l’analisi densitometrica di estratti totali di proteine hanno mostrato un più alto livello di frammentazione della COMP in siti sani ma predisposti a lesione quando confrontati con i siti non predisposti. Inoltre, per la prima volta sono stati descritti i diversi pattern di espressione della COMP in SDFT e DDFT di soggetti giovani e vecchi. Il secondo studio pilota ha analizzato l'aspetto morfologico del tessuto tendineo affetto da lacerazione (tear-type lesion). L'obiettivo è stato quello di valutare l'influenza della lesione sul tessuto adiacente, lontano e remoto al sito della lesione. Il tendine era estremamente alterato vicino alla lesione mentre nelle altre aree rimanevano un’alta cellularità e vascolarizzazione ma l’organizzazione della matrice migliorava notevolmente. La tricromica di Masson distingueva il tessuto danneggiato (blu) da quello sano (rosso) proponendosi come un interessante strumento nelle indagini istologiche. L'immunoistochimica ha mostrato un aumento della marcatura per COMP nelle aree più vicine allo strappo rafforzando gli studi che propongono questa proteina come fondamentale nel rimodellamento della matrice. Aumentando le conoscenze sulla distribuzione della COMP in SDFT e DDFT, e fornendo dati sulla risposta tissutale del tendine lacerato, questi due studi pilota hanno creato una piattaforma utile per le future ricerche con possibili implicazioni cliniche e terapeutiche.