MAPPATURA E CARATTERIZZAZIONE DEI G-QUADRUPLEX IN PROMOTORI DI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

La tubercolosi è una malattia infettiva causata da Mycobacterium tuberculosis. Lo sviluppo di ceppi resistenti ai farmaci antitubercolari normalmente utilizzati rende necessaria la ricerca di nuovi composti per la cura di tale malattia. I G-quadruplex (G4), strutture secondarie che possono formarsi in regioni del DNA ricche in guanina, sono state trovate in promotori di geni umani e virali dove influenzano processi biologici importanti come la trascrizione e la replicazione del DNA. I G4 sono considerati target promettenti per il trattamento di malattie tumorali e infezioni virali grazie alla scoperta di piccole molecole che legano e stabilizzano la loro struttura, inibendo il processo di trascrizione. Recentemente sono stati identificati nel genoma di M. tuberculosis più di 10000 motivi ricchi in guanina che potrebbero formare strutture G-quadruplex. Quarantacinque di essi si trovano a monte o sovrapposti al sito di inizio della trascrizione di geni distribuiti tra diverse categorie funzionali. Analisi in vitro hanno confermato la formazione delle strutture G-quadruplex in quattro di questi geni (mosR, zwf1, clpX e ndhA). Per saggiare la possibilità che le strutture G4 possano essere utilizzate come bersagli terapeutici, è stato valutato l’effetto di due molecole, in grado di legare e stabilizzare la struttura G4 (BRACO-19 e c-exNDI 2), sulla crescita di M. tuberculosis. Abbiamo dimostrato che tali composti riescono ad inibire la crescita micobatterica con una minima concentrazione inibente nel range micromolare rendendo anche il batterio più sensibile allo stress ossidativo. Inoltre sono state studiate le interazioni tra BRACO-19 e alcuni farmaci antitubercolari, il legante del G4 ha un effetto additivo se usato assieme all’isoniazide, mentre in combinazione con l’etambutolo ha un effetto indifferente. Per studiare l’influenza delle strutture G4 nella trascrizione, è stata valutata l’espressione dei geni mosR, zwf1, clpX e ndhA in presenza di BRACO-19. Uno studio più approfondito è stato svolto sul promotore del gene zwf1. Oligonucleotidi a singolo filamento con la stessa sequenza della regione promotoriale di zwf1 interessata alla formazione della struttura G4 sono stati mutati e analizzati con dicroismo circolare: una singola mutazione era richiesta per distruggere la struttura G-quadruplex nel promotore di zwf1. Tale mutazione è stata utilizzata in M. tuberculosis per caratterizzare in vivo l’attività del promotore attraverso la misurazione dell’espressione della proteina reporter eGFP (posta sotto il controllo del promotore wild-type e mutato) dopo trattamento del batterio con H202 o BRACO-19. I dati ottenuti suggeriscono, che almeno nelle condizioni da noi utilizzate, la struttura G4 a monte di tale gene non ha un ruolo preminente nella regolazione genica.