Edophytes Watching: combining molecular and microscopy approches to isolate, identify, tag, and monitor fungi and bacteria inside plants

Questo lavoro ha come obbiettivo, lo studio con diversi approcci delle interazioni tra piante ed endofiti, sono perciò stati esaminati sia microrganismi batterici che fungini. Per quanto riguarda i microrganismi fungini, sono state studiate le specie endofitiche riscontrabili in piante di orchidea, sia come possibili partner micorrizici che come generici colonizzatori interni. Abbiamo analizzato tre diverse specie di orchidee selvatiche, considerate in pericolo, ritrovate nell’area dei Colli Euganei (Orchis militaris, Spiranthes spiralis e Orchis purpurea) per le quali poco si conosce riguardo alla presenza ed alla natura dei simbionti. Per questo studio è stato scelto un approccio che prevedeva l’utilizzo sia di metodologie molecolari che di tecniche di microscopia; inoltre per ottenere miceli fungini in coltura pura si è provveduto a isolarli dalle radici delle piante sterilizzate in superficie. L’approccio molecolare ci ha permesso di amplificare la regione ITS, partendo sia da miceli in coltura pura che direttamente da porzioni di radici. La regione ITS è una regione facilmente amplificabile con un numero relativamente esiguo di primers, per il suo alto numero di copie e per l’alta conservazione delle regioni che la fiancheggiano. Ulteriormente questa regione ci permette di ottenere interessanti informazioni, in quanto varia relativamente poco all’interno delle specie, ma molto tra specie diverse. Per ogni specie di orchidea analizzata sono stati ottenuti diversi ampliconi, che sono stati differenziati in base ai lori diversi profili ARDRA in seguito a digestione enzimatica. I casi più rappresentativi sono stati sequenziati e i risultati sono stati analizzati su piattaforma BLAST. Mediante analisi di omologie di sequenze sono stati identificati alcuni funghi di natura micorrizica e una serie di altri funghi endofitici, che risultano essere una componente importante della biodiversità fungina all’interno dei tessuti delle piante. Diversi tipi di microscopia: a fluorescenza, confocale ed elettronica a trasmissione sono stati usati per localizzare gli stessi funghi all’interno dei tessuti e analizzarne le caratteristiche. I setti (dolipori) ritrovati nelle ife fungine all’ interno dei campioni di Orchis militaris Spiranthes spiralis erano caratteristici dei basidiomiceti. Queste osservazioni hanno perciò permesso di confermare i risultai ottenuti dalle indagini molecolari. Partendo da un precedente lavoro nel quale è stata dimostrata la coesistenza di rizobi e altri batteri endofitici all’interno di noduli di leguminose selvatiche, per questo progetto si sono considerati anche gli endofiti di tipo batterico. In particolare per localizzare gli endofiti all’interno dei tessuti delle piante si è deciso di utilizzare dei marker fluorescenti diversi per tipi differenti di batteri endofitici e rhizobi. In alcuni ceppi batterici è stato inserito il gene codificante la proteina GFP usando un plasmide pUTgfr2X. Questo sistema trasporta un mini trasposone-Tn5, che esprime oltre alla proteina fluorescente anche la resistenza alla kanamicina. Per ottenere i ceppi marcati con RFP si è dovuto manipolare il plasmide pRL765gfp sostituendo il gene codificante la GFP con quello per la RFP, ricavando così un nuovo plasmide chiamato pRL765rfp. Per quanto riguarda i rizobi sia pRL765rfp che pUTgfp2X sono stati introdotti per coniugazione in R. leguminosarum bv. trifolii, così che i geni codificanti le proteine fluorescenti si integrassero nel cromosoma. Considerando invece le specie endofitiche diverse dai rizobi, un ceppo di Pseudomonas sp. Hs1::gfp è stato ottenuto introducendo per coniugazione in Pseudomonas sp. wt il plasmide pUTgfp2X. Pseudomonas sp. wt era stato precedentemente isolato da noduli di leguminose selvatiche così come Enterobacter agglomerans. Quest’ultimo ceppo (Enterobacter agglomerans) è stato marcato con la RFP introducendo il plasmide pRL765rfp per elettroporazione. I quattro ceppi batterici ottenuti sono stati utilizzati per inoculare piantine di Trifolium repens nei test di nodulazione, utilizzando il microscopio confocale è stato possibile localizzare i batteri sulla superficie delle radici o all’interno delle stesse Successivamente gli stessi endofiti marcati, utilizzati nei test di nodulazione su T. repens (Pseudomonas sp. Hs1::gfp e Enterobacter agglomerans pRL765rfp), sono stati co-inoculati in plantule di leguminose selvatiche della Sardegna per investigare la loro abilità di essere dei veri endofiti. Per questa ultima parte del lavoro si sono utilizzate comuni tecniche di isolamento e amplificazione del DNA dei procarioti tramite PCR. Pseudomonas sp. Hs1::gfp in particolare è in grado di colonizzare una delle specie analizzate (Tetragonolobus purpureus) e di essere traslocato nelle parti aeree.