The stilbene synthase multigenic family in grapevine: gemome-wide analysis and transcriptional regulation

Gli stilbeni rappresentano un gruppo minore di fenilpropanoidi, caratterizzati da una matrice chimica difenil-etilenica, rilevabili solamente in un ristretto gruppo di piante superiori tra cui alcune specie di pino (Pinaceae), arachide (Fabaceae), Sorgo (Poaceae) e vite (Vitacea) (Morales et al., 2000). Come avviene per altri fenilpropanoidi, ad es. nel caso dei flavonoidi, l’accumulo di stilbeni è legato per lo più all’esposizione della pianta a stress di tipo biotico e non, tra i quali danneggiamento meccanico, esposizione a radiazione ultravioletta (UV-C), infezione e trattamento con sostanze chimiche (Dixon and Paiva 1995). Nell’arco degli ultimi decenni gli stilbeni, e il resveratrolo in particolare, hanno catalizzato l’attenzione di numerosi studi scientifici, in virtù delle loro proprietà biologiche e mediche. Dal punto di vista biologico, queste sostanze possiedono svariate funzioni, fungendo da deterrenti contro erbivori e insetti (Torres et al. 2003), da composti ad azione anti fungina (Morales et al., 2000; Jeandet et al., 2002), da sostanze allelopatiche (Seigler 2006; Fiorentino et al., 2008) e da antiossidanti (Privat et al., 2002). Dal punto di vista medico, sembrano invece coinvolti in un generale allungamento delle prospettive di vita, rivestendo un ruolo importante nella prevenzione e cura di malattie cardio-respiratorie, neuro-degenerative ed altre malattie quaili cancro, diabete, ecc… (Baur et al., 2006). La pathway di sintesi degli stilbeni può essere considerata una pathway “alternativa” a quella che sovrintende alla biosintesi dei flavonoidi. Tutte le piante superiori sono in grado di produrre composti quali il p-cumaroyl CoA o il cinnamoyl CoA, attraverso l’azione di enzimi ubiquitari nel regno vegetale quali la fenilanina ammonia liasi (PAL), la cinnamato 4-idrossilasi (C4H) o la 4-cumaroil–CoA ligasi (4CL). Questi composti rappresentano il substrato di partenza per la chalcone sintasi (CHS), enzima chiave che porta allo scaffold di sintesi dei flavonoidi. Soltanto in quelle piante in grado di produrre e accumulare stilbeni queste molecole fungono da substrato anche per le stilbene sintasi (STS), una classe di enzimi strettamente correlate alle chalcone sintasi, responsabili della biosintesi di resveratrolo e degli stilbeni in generale. Le STSs appartengono alla superfamiglia delle poliketide sintasi del tipo III, di cui la CHS rappresenta il principale esponente. Alcune specie vegetali, tra cui pino (Pinus spp.), Fallopia japonica (Polygonum cuspidatum) o vite (Vitis vinifera) in alcuni stadi di sviluppo della bacca, sono in grado di accumulare queste molecole in modo costitutivo (Beñová et al., 2008). Nonostante ciò, gran parte degli studi sull’accumulo di stilbeni è stata condotta in arachide o vite, piante nelle quali la presenza di tali composti è prevalentemente legata alla risposta a stress di tipo biotico e abiotico, come risultato dell’attivazione trascrizionale delle STSs e di geni codificanti per enzimi a monte nella pathway generale dei fenilpropanoidi quali PAL o C4H (Lanz et al., 1990; Bais et al., 2000). A oggi, non esiste alcuna informazione riguardo a fattori di trascrizione (TFs) coinvolti nella regolazione di questa pathway, tuttavia, nel corso degli ultimi anni, un numero sempre maggiore di informazioni si è accumulato per ciò che concerne la regolazione della pathway dei flavonoidi. In tale contesto, un ruolo fondamentale sembra ascrivibile alla sottofamiglia dei fattori di trascrizione MYB-R2R3, responsabili della regolazione del metabolismo dei flavonoli, lignine e antocianine (Boudet 2007). Il gruppo dei MYB-R2R3 rappresenta una delle sotto-famiglie di TFs più numerose nel regno vegetale, con ben 108 membri identificati da una recente analisi della copertura 8.4X del genoma di vite (Matus et al., 2008). In vite, la caratterizzazione funzionale di alcuni MYB-R2R3 ha mostrato il loro coinvolgimento in diversi steps della biosintesi dei flavonoidi: VvMYBA1 e VvMYBA2 sono ad esempio coinvolti nella regolazione delle sintesi di antocianine, VvMYB5A, VvMYB5B e VvMYBPA1 regolano diversi geni strutturali della pathway dei flavonoidi, mentre VvMYB12 sembra coinvolto nella sintesi di flavononi (Bogs et al., 2007; Walker et al., 2007; Deluc et al., 2008). L’obbiettivo di questo studio si è articolato in due macroargomenti principali: la caratterizzazione genomica e trascrizionale dell’intera famiglia multigenica delle stilbene sintasi in vite e l’individuazione, con conseguente caratterizzazione funzionale, di fattori di trascrizione coinvolti nella sua regolazione. La caratterizzazione genomica dell’intera famiglia delle stilbene sintasi in vite si è sviluppata dapprima mediante l’identificazione, l’annotazione e lo studio delle relazioni filogenetiche che intercorrono tra i diversi membri di tale famiglia e, in seguito, valutando il profilo di espressione di ogni singolo gene in diversi organi in vari stadi di sviluppo e in dischi fogliari sottoposti a stress di varia natura. In quest’ultimo caso, l’espressione dei membri identificati nel genoma con copertura 12X V1 è stata saggiata tramite analisi dell’intero trascrittoma (mRNA-seq) usando una tecnologia di sequenziamento di nuova generazione (NGS) Illumina e rilevando l’esistenza di diversi gruppi di STSs caratterizzati da gradi diversi di responsività ai vari stress. L’analisi di espressione in diversi organi e stadi di sviluppo è stata invece realizzata in collaborazione con l’Università di Verona, che ha fornito un atlante di espressione basato su tecnologia microarray di tipo Nimblegen e Combimatrix. Le sonde presenti su tali chip sono state disegnate sulla base delle predizioni ottenute dalla copertura 12X V1 del genoma ottenuto dalla linea PN40024 e ibridate con numerosi organi di vite, tra cui foglia, bacca divisa in esocarpo, endocarpo e seme, radici in vitro, germoglio, tendrile ecc…Tali tessuti sono stati considerati in diversi stadi temporali tra i quali allegagione, invaiatura, pre-maturazione, maturazione e appassimento per ciò che riguarda bacca o stadi giovanili o senescenti per foglia. In questo caso le analisi hanno parzialmente validato i dati ottenuti nell’analisi mRNA-seq oltre a fornire un quadro dettagliato del pattern di espressione di questi geni nell’intero sistema pianta in assenza di stress. Il secondo scopo del lavoro di seguito presentato è stato l’identificazione di fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione della pathway biosintetica responsabile della sintesi di stilbeni. Data la stretta relazione che intercorre tra la pathway di sintesi degli stilbeni e quella dei flavonoidi, e sulla base delle numerose evidenze scientifiche che legano la regolazione di quest’ultima alla attività di MYB-R2R3, (Deluc et al. 2008; Bogs et al. 2007; Walker et al. 2007), i dati Illumina ottenuti dai tessuti stressati sono stati analizzati con lo scopo di individuare geni MYB-R2R3 co-espressi con le VvSTS. Di 108 MYB-R2R3 analizzati, soltanto due geni hanno evidenziato un pattern di espressione correlato a quello delle VvSTS. Tali geni sono già stati annotati da Matus et al. (2008) e prendono il nome di VvMYB14 e VvMYB15. Successive analisi real time su dischi fogliari sottoposti a stress biotici e non, hanno confermato una marcata co-espressione tra VvMYB14 in particolare e due VvSTS altamente stress-inducibili (VvSTS22 e VvSTS36). Tramite saggio “gene reporter” è stata validata una reale interazione tra VvMYB14 e le sequenze promotoriali di queste due stilbene sintasi e, al fine di confermare il ruolo di VvMYB14 anche in planta, sono state create delle linee silenziate di Hairy Roots. In uno screening preliminare delle linee trasformate, quelle che mostrano il più alto grado di silenziamento di VvMYB14 sono anche quelle che mostrano il più basso grado di induzione di VvSTS36, confermando un ruolo di questo fattore di trascrizione nella regolazione trascrizionale della pathway biosintetica delle stilbene sintasi.