Study of the contribution of muscle inflammation, IMAT origin and microenvironment to sarcopenic obesity

Introduzione La condizione ottimale attraverso cui il muscolo scheletrico può espletare la propria funzione è rappresentata da un’ efficiente attivazione dei processi che regolano lo sviluppo, la crescita, la rigenerazione e il metabolismo del muscolo stesso. Quando viene a mancare l’equilibrio tra questi eventi è il momento in cui insorge una condizione patologica. Nello specifico, una perdita o riduzione di massa e funzionalità muscolare è collegata a gravi malattie, quali distrofie, cancro, obesità e processi di invecchiamento. In questo contesto, l’obesità sarcopenica, una malattia metabolica che porta ad atrofia delle fibre muscolari e riduzione delle cellule staminali (chiamate nel muscolo cellule satelliti), è associata ad un aumento in zone ectopiche di tessuto adiposo, a riduzione della tolleranza al glucosio e a perdita di forza e motilità soprattutto in adulti e anziani. Questo accumulo di acidi grassi in altri distretti corporei, compreso il muscolo scheletrico, induce disfunzioni metaboliche, alterazioni nella β-ossidazione, aumento di produzione di ROS, lipotossicità e insulino-resistenza. Inoltre questo tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) agisce come chemoattrattivo per le cellule infiammatorie, soprattutto macrofagi, che, una volta in sede, producono elevate quantità di citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-6, IL-1, INFγ) e basse quantità di citochine anti-infiammatorie (IL-4, IL-10). Tutto ciò porta ad un costante basso grado di infiammazione sistemica e a conseguente perdita di massa muscolare. Scopo Scopo di questo lavoro è quello di investigare l’origine del tessuto adiposo intermuscolare e i meccanismi che regolano il dialogo tra questo e il tessuto muscolare circostante. La prima parte dello studio ha lo scopo di capire, utilizzando biopsie muscolari, le differenze che ci sono a livello di infiammazione del muscolo in soggetti obesi normoglicemici e diabetici rispetto ai pazienti sani. Inoltre, analizzando i sieri di pazienti che appartengono alle stesse categorie sopraelencate, saranno individuati possibili miRNA da utilizzare come marcatori identificativi delle alterazioni muscolari in presenza di obesità. Poiché in malattie croniche, quali obesità e diabete di tipo2, diversi fattori contribuiscono alla patologia, abbiamo deciso di investigare anche il microambiente del muscolo scheletrico, inteso come matrice extracellulare (ECM). Utilizzando un modello murino di obesità cercheremo di capire se questo può avere un ruolo nella deposizione dell’IMAT e dei processi infiammatori ad esso associati. Materiali e metodi Sia biopsie muscolari sia campioni di siero sono stati prelevati da pazienti sani, obesi normoglicemici e obesi diabetici. Mediante l’utilizzo di analisi di Real-time PCR le prime sono state analizzate per i principali marcatori infiammatori, mentre i secondi per i principali miRNA muscolari circolanti. Nella seconda parte dello studio, invece, è stato settato un protocollo di decellularizzazione del tipo detergente enzimatico su quadricipiti murini di topi wild type (C57BL6J) e di topi ob/ob (B6.Cg-Lepob/J) e i campioni ottenuti sono stati caratterizzati per il contenuto di DNA e le componenti strutturali della matrice. In seguito è stato creato un modello di perdita consistente di massa muscolare in topi wild type (wt) ed è stata impiantata nelle sede di danno una porzione di matrice proveniente da topi wt o ob/ob. La capacità delle diverse matrici di essere rimodellate e riassorbite è stata analizzata dopo 7, 15 e 30 giorni mediante analisi di immunofluorescenza e molecolari. Risultati e discussione L’mRNA estratto da 3 biopsie di retto addominale di pazienti obesi normoglicemici e obesi diabetici, insieme a 3 biopsie di muscolo peroniere di soggetti sani indica la presenza di una maggiore espressione dei geni pro-infiammatori sia nei soggetti obesi normoglicemici sia diabetici in confronto a quelli sani. Tuttavia, in contrasto con quanto ci aspettavamo, i pazienti diabetici che erano in trattamento con Metformina da almeno 1 anno mostravano un grado infiammatorio inferiore. Osservando poi i livelli di miRNA 133a, miR133b e miR1 presenti nel siero di una coorte di pazienti sani, obesi normoglicemici e obesi diabetici abbiano notato lo stesso andamento descritto in precedenza per le biopsie muscolari. Questo ci suggerisce una possibile correlazione diretta tra infiammazione muscolare e rilascio di questi miRNA circolanti, che in futuro potranno essere utilizzati come marcatori della condizione muscolare del paziente. La decellularizzazione dei quadricipiti wt e ob/ob non ha evidenziato differenze strutturali tra le due matrici. Inoltre il trapianto in vivo di entrambe ha indotto a 7 giorni una forte migrazione cellulare all’interfaccia tra tessuto nativo e matrice, la quale diminuisce a 15 e 30 giorni dopo impianto. Cellule macrofagiche (CD68+) sono state trovate in entrambe le matrici, soprattutto nelle aree attorno ai punti di sutura e all’interfaccia con il tessuto nativo, tuttavia a nessun time point è evidente una condizione infiammatoria nella parte più interna del muscolo nativo. La colorazione Alcian Blue e quella della Tricromica di Masson hanno mostrato un’ induzione nella deposizione di glicosamminoglicani e di collagene simile tra le due matrici. Nello specifico, abbiamo osservato, quindi, che una matrice derivante da un donatore affetto da malattia metabolica non è in grado di indurre un’alterazione nella deposizione di componenti strutturali ma promuove una prematura risposta infiammatoria di tipo M2 che si riduce o stabilizza dopo 30 giorni dall’impianto. Al contrario, la matrice proveniente da topi sani induce una ricostruzione del tessuto più ritardata ma che porta a una miglior e completa rigenerazione. Nessuna differenza, infine, è stata osservata in termini di attivazione e modulazione dei segnali miogenici e adipogenici per entrambi gli impianti.