Molecular Characterization of Vibrio spp. in Shellfish using Multilocus Sequence Analysis

I prodotti ittici sono la seconda fonte di proteine per l’alimentazione dell'uomo e in alcuni Paesi, quali il Giappone, ne costituiscono la principale fonte. Negli ultimi anni, i batteri marini della flora indigena sono risultati responsabili del 20% delle malattie nell’uomo e del 99% dei decessi derivati dal consumo dei prodotti della pesca. Tra questi, le principali cause di malattie sono da ascrivere ad alcune specie di Vibrionaceae in particolare al genere Vibrio, che possono causare gastroenteriti, soprattutto a seguito di consumo di prodotti crudi o poco cotti, provenienti da mari temperati e caldi. L'identificazione accurata dei batteri appartenenti al genere Vibrio risulta quindi molto importante per valutare i rischi in materia di salute pubblica e per l’identificazione puntuale delle malattie degli organismi acquatici. Risulta quindi necessario sviluppare ed applicare metodi affidabili che possano caratterizzare le specie di vibrioni residenti nei prodotti commercializzati (es. molluschi bivalivi e crostacei). In particolare, i metodi di identificazione basati sull’analisi delle sequenze geniche sono preferibili rispetto ai classici approcci biochimici. In questo studio è stato sviluppato uno schema MLSA Multilocus Sequence Analysis impiegando quattro geni housekeeping (gyrB, pyrH, recA e atpA), tale schema è stato valutato in 3 differenti data set di ceppi (154 isolati da molluschi nel 2007; 92 isolati di crostacei e 22 da molluschi isolati nel 2011) e 29 ceppi di riferimento e Type strain. I concatenameri sono stati utilizzati per le analisi filogenetiche e per gli studi di popolazione dei Vibrio isolati, confrontando al contempo i risultati dell’identificazione di specie con i test biochimici (schema di Alsina) applicati di routine all’identificazione dei Vibrioni. L’analisi della struttura di popolazione mediante il software STRUCTURE e l’analisi filogenetica risultano concordi nell’assegnazione dei principali taxa evidenziando una simile clusterizzazione dei gruppi in sottopopolazioni. Al contrario, il confronto tra la classificazione mediante MLSA e i test biochimici ha evidenziato varie discrepanze tra le quali una sovrastima di ceppi classificati come V. parahaemolyticus e V. vulnificus. Al contempo alcuni ceppi di V. parahaemolyticus sono risultati falsi negativi. Questi riscontri potrebbero indicare una limitazione dell’utilizzo delle prove biochimiche adottate di routine alla classificazione dei Vibrio potenzialmente patogeni per l’uomo e tale riscontro si riflette in un possibile rischio per la salute pubblica. La seconda parte dello studio ha considerato nel dettaglio la caratterizzazione molecolare di V. parahaemolyticus. Questo batterio è oggi un patogeno emergente derivato dal consumo di prodotti ittici, infatti ceppi patogeni di V. parahaemolyticus rappresentano una delle principali cause di gastroenterite di origine alimentare, in particolare in alcuni paesi dell’Asia e negli Stati Uniti. Questo batterio, a causa di mutamenti ambientali e delle abitudini dei consumatori (consumo di prodotti crudi provenienti da aree contaminate) potrebbe rappresentare una problematica igienico sanitaria anche nel Mare Adriatico settentrionale. In questa parte dello studio sono stati esaminati 160 ceppi isolati da 43 campioni di molluschi commestibili campionati tra gennaio e ottobre 2011 e identificati a livello biochimico dal laboratorio di microbiologia dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe). I ceppi sono stati caratterizzati per la presenza dei marker genici specie specifici (toxR e tlh - Vibrio parahaemolyticus) per confermare l'identificazione biochimica e quindi dei geni per i fattori di virulenza (tdh e trh). I ceppi risultati di dubbia o errata identificazione sono stati sottoposti a MLSA (Multilocus Sequence Analysis) valutando la sequenza dei 4 geni housekeeping. Infine tutti i ceppi risultati Vibrio parahaemolyticus (n° 102) sono stati analizzati mediante il protocollo MLST (http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/.). Lo schema prevede l’analisi di sequenza di 7 porzioni geniche (dnaE, gyrB, recA, dtdS, pntA, pyrC and tnaA). I concatenameri ottenuti sono stati utilizzati nelle analisi bioinformatiche di popolazione per determinare le relazioni tra i diversi ceppi isolati in questo studio e, in seconda battuta, per evidenziare eventuali collegamenti con ceppi isolati a livello mondiale. Per quanto concerne i fattori di virulenza tutti i ceppi di V. parahaemolyticus sono risultati tdh negativi, mentre 6 ceppi hanno presentato la positività per il gene trh. Nel complesso sono stati identificati 72 profili ST non ridondanti, 63 dei quali di nuova attribuzione rispetto al database on-line. L’analisi clonale dell’intero database ha evidenziato la presenza di 54 gruppi clonali dei quali 17 risultano essere ascritti entro un complesso clonale. Le analisi di popolazione nel loro complesso delineano la presenza di due gruppi principali di V. parahaemolyticus. Dallo studio emerge che, nonostante sia stata riscontrata un’alta percentuale di campioni positivi per V. parahaemolyticus, solo pochi ceppi risultano potenzialmente patogeni per l'uomo. Tuttavia, alcune possibili relazioni genetiche con ceppi isolati da casi di gastroenteriti in varie parti del mondo emergono dallo studio comparativo con il database on-line. La caratterizzazione molecolare potrebbe aiutare a individuare genotipi sospetti e quindi chiarire la dinamica della diffusione di ceppi potenzialmente patogeni.