Gcn4 misregulation reveals a novel role for EKC/KEOPS complex in the t6A37 tRNAs modification

Il complesso EKC/KEOPS è costituito nel lievito da cinque subunità: tre piccole proteine (Pcc1, Pcc2 e Cgi121), di cui non sono note caratteristiche biochimiche rilevanti, Bud32, una protein chinasi atipica e Kae1, la cui funzione è sconosciuta. Fatta eccezione per Pcc2, presente solo nei Funghi, l’intero complesso EKC/KEOPS è conservato negli Archaea e negli Eucarioti, mentre Kae1, il membro più conservato e, probabilmente, più antico del complesso, presenta ortologhi anche nei Batteri. Sebbene il complesso sia implicato in diversi processi cellulari, tra cui trascrizione, omeostasi telomerica e mantenimento della stabilità genomica, il suo preciso meccanismo d’azione o la sua precisa funzione molecolare non sono mai stati descritti finora. Il mio lavoro di Ricerca svolto durante il Dottorato è inserito in una rete di collaborazioni volta ad elucidare i possibili meccanismi d’azione molecolare del complesso, adottando diversi approcci sperimentali e usando il lievito Saccharomyces cerevisiae come organismo modello. All’inizio del mio Dottorato, ho preso parte allo studio della relazione enzima/substrato che già diversi dati indicavano per Bud32 e Kae1. In particolare, ho provato a definire l’importanza e il ruolo fisiologico della fosforilazione della serina in posizione 367 di Kae1, identificata, grazie ad analisi di spettrometria di massa (MS), come uno dei residui di Kae1 fosforilati da Bud32. I risultati di un test di fosforilazione in vitro, condotto usando proteine ricombinanti, tra cui una forma di Kae1 mutagenizzata (e quindi non più fosforilabile) in posizione 367 come substrato di Bud32, assieme all’analisi del fenotipo di crescita di un ceppo di lievito mutante kae1-S367A, indicano che la serina367 non è il principale residuo di Kae1 ad essere fosforilato da Bud32. Per poter identificare e definire l’importanza di altri residui di Kae1 fosforilati da Bud32, saranno quindi necessarie ulteriori analisi. Parallelamente, l’analisi del trascrittoma di ceppi esprimenti subunità mutanti del complesso EKC/KEOPS (eseguite dal gruppo diretto da Frank Holstege), ha rivelato uno specifico profilo di geni up-regolati: fra i trascritti risultati particolarmente arricchiti sono stati identificati quelli corrispondenti ai geni bersaglio dell’attivatore trascrizionale Gcn4. L’espressione di GCN4, il principale regolatore del controllo generale degli amminoacidi, è regolata a livello traduzionale, attraverso un meccanismo di regolazione dell’iniziazione che dipende da 4 ORFs presenti nella regione 5’ UTR dell’mRNA di GCN4 (uORFs 1-4). Usando diversi reporter Gcn4-LacZ, abbiamo dimostrato che la traduzione di GCN4 è derepressa nei mutanti EKC/KEOPS, in seguito a una ridotta capacità di riconoscere le uORFs inibitorie. Altri collaboratori e anche due gruppi in modo indipendente hanno dimostrato il deficit della modificazione universalmente conservata t6A37 (una treonil-carbamoilazione del residuo di adenosina in posizione 37 di tutti i tRNA che decodificano codoni ANN, incluso il tRNA iniziatore tRNAiMet) nei mutanti EKC/KEOPS. Questa modificazione è necessaria per il corretto riconoscimento codone-anticodone e per la stabilità di questa interazione. Un difetto di t6A37 altera la traduzione a diversi livelli, in particolare la fase iniziale della traduzione, ed è la causa della derepressione di Gcn4 nei mutanti EKC/KEOPS. Ciò è inoltre supportato da dati che dimostrano l’esistenza di una forte interazione genetica tra i mutanti EKC/KEOPS e il fattore eIF5 implicato nell’inizio della traduzione, ma anche con geni coinvolti nella biosintesi della treonina o nel metabolismo dei tRNA. A questo punto, ci siamo chiesti se il complesso EKC/KEOPS sia in grado di modificare, mediante l’aggiunta di un gruppo treonil-carbamoilico all’adenosina, anche altri RNA oltre ai tRNA. Ho quindi tentato di riprodurre un esperimento di “primer extension” già pubblicato, in cui si correla l’assenza della modificazione t6A con la scomparsa/diminuzione di una banda d’arresto in corrispondenza del nucleotide A37, prodotta durante l’allungamento di un primer radiomarcato durante la retrotrascrizione di un tRNA che decodifica un codone ANN. Una volta messa a punto la tecnica usando un substrato già testato, avrei potuto analizzare qualsiasi altro tipo di RNA, scegliendo un appropriato oligonucleotide da estendere. Tuttavia, anche usando diverse condizioni sperimentali identiche o comparabili a quelle pubblicate, non sono mai riuscita ad ottenere lo stesso risultato. Allo scopo di identificare gli RNA legati dal compesso EKC/KEOPS, abbiamo scelto una strategia che associa l’immunoprecipitazione dell’RNA (RIP) al suo sequenziamento. Nella parte finale dei risultati descrivo le diverse tappe dell’esperimento RIP che ho iniziato a mettere a punto. Il risultato principale derivante dal lavoro presentato in questa tesi è la dimostrazione del coinvolgimento del complesso EKC/KEOPS nel processo di traduzione, come conseguenza del suo ruolo diretto nella modificazione t6A37 dei tRNAs. Questo risultato rappresenta una nuova svolta nella comprensione della funzione primaria del complesso e del suo impatto su diverse funzioni cellulari essenziali, tra cui la trascrizione e l’omeostasi dei telomeri