Biotechnological optimization of microalgae for the sustainable production of biocommodities

Le attuali tendenze di sviluppo economico mondiale si basano fortemente sullo sfruttamento di combustibili fossili, che sono responsabili di un netto rilascio di gas serra (ad esempio CO2) nell'atmosfera. Nel 2014, il gruppo intergovernativo di esperti sui cambiamenti climatici (IPCC), ha dichiarato che questo incremento netto di CO2 atmosferica è di origine antropogenica, e che porterà all’aumento della temperatura globale di > 2 °C, prima della fine di questo secolo. Quest'ultimo contribuirà fortemente alla modifica del comportamento del clima e degli oceani (ad esempio portando alla loro acidificazione ed ossigenazione) in modo permanente, con conseguente aumento delle pressioni demografiche sulla sicurezza alimentare e idrica, nonché sulla bio-diversità funzionale di diversi ecosistemi. Per evitare questo scenario apocalittico, lo sviluppo di fonti energetiche rinnovabili e pulite per sostenere una parte consistente dell'economia globale è una sfida inevitabile per la nostra società. Un'economia basata sulla biomassa vegetale potrebbe soddisfare questa esigenza, ma diversi studi hanno previsto un’inflazione dei prezzi alimentari e un concreto debito di carbonio, come conseguenza di questo scenario. Al contrario, lo sfruttamento della biomassa delle microalghe potrebbe in realtà evitare questi problemi e portare ad un effetto positivo sui livelli di CO2, portando al suo sequestro e fissazione in carbonio organico. Attualmente, le microalghe sono infatti i migliori organismi capaci di sequestrare la CO2, grazie a tassi fotosintetici più elevati rispetto alle piante. La loro capacità di crescere su terreni marginali e sfruttando le acque di scarto apre le porte per la loro applicazione come agenti in grado di mitigare l’impatto ambientale degli attuali processi industriali. Il loro impiego potrebbe essere infatti la chiave per lo sviluppo di un processo integrato in cui la biomassa dovrebbe essere usata per convertire la maggior dell'economia attuale verso processi rispettosi dell'ambiente. Nonostante questo scenario promettente, attualmente soprattutto specie di microalghe di tipo selvatico sono impiegate a questi scopi. La loro evoluzione in un ambiente naturale, diverso da quello artificiale sfruttato durante la coltivazione industriale intensiva, ostacola fortemente le produttività teoriche della biomassa, portando a valori insoddisfacenti. Lo sviluppo di un'economia basata sulle alghe infatti dipende dall’efficiente conversione dell'energia luminosa in biomassa e dall'ottimizzazione delle vie metaboliche per massimizzare la sintesi dei prodotti di interesse. Ancora lontani dallo sviluppo di una coltivazione industriale di microalghe economicamente competitiva ed energicamente sostenibile, questi organismi devono quindi subire un’ottimizzazione biotecnologica per raggiungere la soglia di competitività. Sebbene non ci sia una specie ideale che potrebbe servire a soddisfare tutti i bisogni umani, noi ci siamo concentrati sulla specie di acqua marina Nannochloropsis gaditana, che è un candidato promettente sia per indagini biologiche di base che applicative. La seguente tesi di dottorato è stato concepita per fornire un’investigazione molecolare sull’efficienza fotosintetica e la regolazione metabolica di N. gaditana, al fine di fornire i bersagli molecolari per il suo miglioramento biotecnologico. Il presupposto di questo lavoro sperimentale era l'ottimizzazione degli strumenti molecolari attualmente disponibili per la manipolazione genetica di N. gaditana e anche le informazioni molecolari disponibili sono state quindi significativamente migliorate. Nel capitolo II è stato eseguito un approccio di mutagenesi casuale al fine di isolare ceppi mutanti con fenotipi fotosintetici, possibilmente più adatti alle condizioni di crescita intensiva. I ceppi selezionati in effetti hanno mostrato un miglioramento della fotosintesi in condizioni di crescita limitanti, rappresentando anche degli strumenti biologici per migliorare le informazioni disponibili sugli elementi molecolari alla base del controllo dell’efficienza dell’uso della luce in questo organismo. Quando testato in condizioni di crescita su scala di laboratorio, il ceppo E2, selezionato per una riduzione del contenuto in clorofilla, ha infatti mostrato un miglioramento della produttività della biomassa, rappresentando quindi una conferma per gli approcci biotecnologici qui sviluppati, di essere in grado di migliorare le prestazioni fotosintetiche di questo organismo, nell'ambiente artificiale di un fotobioreattore. Tra i ceppi mutanti isolati, nel capitolo III, due principali fenotipi fotosintetici, la riduzione nel contenuto di clorofilla (ceppo E2) e l'impossibilità di attivare il meccanismo di NPQ (ceppo I48), sono stati scelti come criteri di selezione per migliorare, rispettivamente, i meccanismi di penetrazione della luce e di conversione dell'energia luminosa in una cultura intensiva. Entrambi infatti hanno mostrato una produttività della biomassa maggiore nelle culture che simulano le condizioni industriali, dimostrando il vantaggio teorico dato dal loro sfruttamento. Tuttavia, quando le condizioni di crescita sono state cambiate, variando la disponibilità di luce, i mutanti selezionati hanno alterato il loro comportamento. Non erano in grado di essere più produttivi del WT in tutte le condizioni testate. Questo spiegherebbe perché i dati pubblicati fino ad oggi per gli stessi mutanti, isolati in altre specie, spesso forniscano risultati contrastanti. Abbiamo quindi concluso che i mutanti fotosintetici possono modulare il loro fenotipo in relazione alle condizioni di crescita e alcune di queste potrebbero infatti evidenziare i loro svantaggi piuttosto che i loro benefici. Pertanto, i futuri approcci di ingegneria genetica dovranno essere adattati adeguatamente alle condizioni di crescita utilizzate. La strategia di genetica diretta qui sviluppata potrebbe aprire le porte verso l'individuazione delle basi molecolari che regolano la fotosintesi in questa specie promettente. Nel capitolo IV il ceppo mutante I48 è stato ulteriormente indagato per individuare le basi genetiche responsabili del suo fenotipo. Grazie al ri-sequenziamento del suo intero genoma abbiamo identificato una variante di splicing nel sito di splicing donatore al 5’ del 4 ° introne del gene Naga_100173g12, che codifica per la proteina LHCX1. Questa mutazione ha causato la ritenzione della sequenza dell’introne, portando ad un prodotto proteico tronco, che viene probabilmente degradato. L'assenza della proteina LHCX1 si correla fortemente con l'incapacità di attivare l’NPQ, dal momento che questo gruppo di proteine è ben noto per essere coinvolto nell'attivazione di tale meccanismo. Tuttavia, la futura complementazione del fenotipo servirà per validare questa conclusione. Inoltre, la proteina LHCX1 è stata trovata co-localizzata con il PSI in N. gaditana, quindi il ceppo I48 potrebbe anche servire come strumento ottimale per indagare ulteriormente il ruolo biologico di questa associazione. Per sviluppare un’efficace strategia di ottimizzazione biotecnologica, le informazioni relative alla regolazione del metabolismo di N. gaditana devono essere notevolmente arricchite. Capire la direzione dei flussi metabolici potrebbe permettere di colpire in particolare solo quelli che sono coinvolti nell’accumulo di un determinato prodotto, senza influenzare altre vie metaboliche, cosa che potrebbe portare ad un possibile impatto negativo sulla crescita. Nel capitolo V un'analisi integrata con approcci genomici, biochimici e fisiologici ci ha aiutato a decifrare il rimodellamento metabolico di N. gaditana, che porta il suo metabolismo verso una maggiore produzione di lipidi in condizioni di luce in eccesso. Quest'ultima condizione infatti induce l'accumulo di di-acilgliceroli (DAG) e tri-acilgliceroli (TAG), insieme alla sovra-regolazione di geni coinvolti nella loro biosintesi. Abbiamo visto l'induzione di geni del complesso citosolico dell’acido grasso sintasi (FAS1) e la sub-regolazione di quelli del cloroplasto (FAS2). L’accumulo di lipidi è accompagnato dalla regolazione di trasportatori di trioso fosfati / fosfato inorganico attraverso le membrane del cloroplasto, inducendo la ripartizione metabolica del carbonio tra compartimenti cellulari e favorendo il citoplasma ed il reticolo endoplasmatico a spese del cloroplasto. Ciò ha evidenziato la flessibilità del metabolismo di N. gaditana al fine di rispondere alle esigenze ambientali. Nel capitolo VI le informazioni acquisite da quest'ultimo capitolo sono state sfruttate per testare le potenzialità di questa specie promettente, anche come piattaforma di espressione di proteine. Abbiamo costruito un sistema modulare per la sovra-espressione di proteine in cui le sequenze regolatrici sono state scelte tra quelle che inducono un elevato livello di trascrizione o che sono altamente regolate dalla disponibilità di luce. N. gaditana si è rivelata essere un organismo molto promettente per l'espressione di proteine, data la maggiore attività luciferasica osservata, rispetto alla specie di riferimento per tali applicazioni, C. reinhardtii. È stato sviluppato un metodo per testare l'efficacia di diverse sequenze regolatrici nel guidare l'espressione di proteine così come sono stati preparati diversi vettori di espressione, pronti per essere testati. L'indagine della regolazione del metabolismo di N. gaditana, svolta nel capitolo V, ha mostrato una fine regolazione dei suoi componenti dell'apparato fotosintetico, in diverse condizioni di luce. Concentrandosi sulle proteine antenna, coinvolte nella cattura delle luce (light-harvesting complex (LHC) proteins) abbiamo identificato una nuova proteina LHCX in questa specie, chiamata LHCX3 (ID del gene: Naga_101036g3), la cui sequenza codificante non era annotata in modo corretto. Nel capitolo VII, la corretta sequenza codificante di questo gene è stata studiata ulteriormente e convalidata sperimentalmente con tecniche molecolari. La proteina LHCX3 ha rivelato la presenza di un dominio simile a quello di tipo fasciclina I, all’N-terminale, e sono stati eseguiti un’analisi di sequenza insieme ad uno studio evolutivo preliminare per dedurre il ruolo biologico di questa associazione. Poiché il metabolismo delle alghe si basa interamente sulla disponibilità di luce, è fondamentale indagare l'effetto dell’intensità della luce sulla crescita per studiare la loro applicazione industriale. Nel capitolo VIII, abbiamo sviluppato una piattaforma su micro-scala, che abbiamo chiamato micro-fotobioreattore, per indagare facilmente l'impatto dell’intensità della luce sulla crescita di N. gaditana. Siamo stati in grado di testare simultaneamente l'effetto di diversi regimi di luce, anche sulle prestazioni fotosintetiche, in un sistema integrato che potrebbe essere associato a studi sull’impatto delle sostanze nutritive, accelerando il processo di caratterizzazione di N. gaditana. Nella tesi sono state incluse anche tre sezioni di appendice, in cui alcune delle tecniche sperimentali sfruttate in questo lavoro sono state applicate a diversi organismi, con l'obiettivo comune di indagare l’efficienza dell’uso della luce e gli elementi molecolari coinvolti nella sua regolazione. Nell’appendice I, è stato descritto lo sviluppo di un modello matematico per la previsione dei dati di crescita e di fluorescenza, nella specie Nannochloropsis salina. Il lavoro è stato svolto in collaborazione con il Prof. Fabrizio Bezzo del dipartimento di ingegneria industriale dell'università di Padova. Lo sviluppo di modelli di previsione del comportamento che rappresentino i fenomeni che influenzano la crescita delle alghe, potrebbe essere molto utile nella progettazione e ottimizzazione dei sistemi di produzione a livello industriale. Il modello sviluppato descrive bene la crescita di N. salina in un ampio intervallo di intensità di luce, e potrebbe essere ulteriormente implementato per descrivere anche l'influenza sulla crescita di altri parametri, come la disponibilità di nutrienti ed il mescolamento. Nell’appendice II, il monitoraggio della fluorescenza della clorofilla in vivo è stato sfruttato per studiare le caratteristiche fotosintetiche di piante di riso, esposte a condizioni di stress salino. I risultati presentati sono parte di un progetto più ampio (in collaborazione con la Prof. Fiorella Lo Schiavo del dipartimento di biologia dell'università di Padova), con l'obiettivo di rappresentare il rimodellamento fisiologico, biochimico e molecolare, subito da una delle principali colture destinate ad usi alimentari nel mondo, in risposta a condizioni di stress salino. La descrizione dell'impatto degli stress ambientali sulla fotosintesi è fondamentale per controllare la produttività della biomassa delle piante poiché il loro metabolismo dipende interamente dalla fotosintesi per la crescita. Abbiamo osservato l'attivazione del meccanismo di NPQ in piante tolleranti il sale, sottolineando l'importanza del monitoraggio delle caratteristiche fotosintetiche per prevedere le prestazioni delle piante, direttamente sul campo. Nell’ appendice III, sono stati isolati i tilacoidi di Chlamydomonas reinhardtii marcati con atomi 13C - 15N, sia dal ceppo cw15 che dal ceppo mutante npq2, al fine di studiare la loro struttura e la dinamica delle proteine e dei lipidi costituenti, in situ, applicando la tecnica dell’NMR allo stato solido, in collaborazione con il gruppo del Prof. Anjali Pandit dell'Istituto di chimica di Leiden. Queste analisi serviranno per studiare il rimodellamento delle membrane fotosintetiche che passano da uno stato attivo (ceppo cw15) ad uno stato foto-protettivo (ceppo mutante npq2), durante il passaggio verso condizioni di luce in eccesso, con lo scopo finale di comprendere i processi biochimici che regolano quest'evento.