Breeding in European sea bass (Dicentrarchus labrax L.): genetic aspects of resistance to VNN and sex determination, and development of genomic prediction tools

Negli ultimi anni la richiesta di prodotti derivanti dall’acquacoltura è aumentata considerevolmente, comportando una maggiore attenzione volta allo sviluppo ed al miglioramento delle tecniche di produzione, compresi programmi di selezione genetica volti al miglioramento di caratteri produttivi (peso, morfologia) e di efficienza delle specie allevate (resa produttiva, efficienza alimentare, qualità del prodotto, resistenza alle malattie). In particolare, la comparsa di infezioni virali e batteriche in avannotteria ed in allevamento, può avere gravi conseguenze, sia in termini economici e produttivi, sia dal punto di vista del progresso e della sostenibilità dell’allevamento stesso. Per questo motivo, l’interesse verso il miglioramento genetico della resistenza alle malattie in specie ittiche è notevolmente aumentato, anche grazie al costante progresso di strumenti e tecniche di biologia molecolare che consentono la genotipizzazione e la generazione di panel di marcatori genome-wide. La selezione per produrre lotti di animali geneticamente migliorati risulta una strategia particolarmente efficace e di specifico interesse per patologie virali o batteriche per le quali le comuni misure di gestione come farmaci ed antibiotici non sono contemplate, presentano scarsa efficacia, o come i vaccini, risultano essere al momento soltanto in fase di sviluppo sperimentale. La selezione genetica per la resistenza alle malattie consente invece un controllo a lungo termine della patologia attraverso un cambiamento permanente delle caratteristiche genetiche degli animali che può essere trasmesso di generazione in generazione. L’encefalopatia e retinopatia virale (o viral nervous necrosis, VNN) è una delle maggiori e più gravi patologie riscontrata in più di 50 specie ittiche, tra cui il branzino (Dicentrarchus labrax L.). Le conseguenze di focolai di VNN in branzino sono decisamente significative, con tassi di mortalità fino al 100% negli stadi larvali e giovanili. Il primo obiettivo del progetto è stato quello di valutare i parametri genetici e genomici per i caratteri di resistenza a VNN. 650 animali prodotti in un allevamento commerciale sono stati quindi sottoposti ad infezione sperimentale con Betanodavirus (nervous necrosis virus, NNV) ed è stato prodotto un dataset di marcatori genome-wide (SNP) mediante approcci di sequenziamento high-throughput (tecnica 2b-RAD). L’ereditabilità per la mortalità intesa come carattere binario (0/1) o come tempo di sopravvivenza ha mostrato valori moderati o lievi (genetica: h2mort = 0,14-0,23, h2surv = 0,07-0,14; genomica: h2mort = 0,06, h2surv = 0,03). Visto l’interesse verso possibili indicatori da utilizzare come criteri di selezione indiretta, sono stati studiati anche parametri fisiologici (livello di cortisolo ematico post-stress) ed immunitari (titolo anticorpale a Betanodavirus) con lo scopo di determinarne la variabilità genetica additiva e la correlazione genetica con i caratteri di resistenza a Betanodavirus. Entrambi i parametri hanno mostrato valori di ereditabilità genetica e genomica interessanti (genetica: h2HC = 0,19-0,23, h2AT = 0.28-0.39, genomica: h2HC = 0,19, h2AT = 0,26). La correlazione genetica tra concentrazione di cortisolo e probabilità di morte è risultata nulla, mentre quella tra titolo anticorpale e probabilità di morte è risultata negativa (ra mort/AT = -0,39). L’ereditabilità genetica e genomica per il peso (548 giorni post-hatching) si è confermata elevata (genetica: h2BW = 0,45-0,60; genomica: h2BW = 0,45); il peso, inoltre, è risultato positivamente correlato dal punto vista genetico ai livelli di cortisolo ed al titolo anticorpale (ra BW/HC = 0,12 e ra BW/AT = 0,49), mentre la correlazione genetica tra questo carattere e la mortalità è risultata negativa (ra BW/mort = -0,39). Il secondo obiettivo del progetto è stato quello di investigare il potenziale predittivo di strumenti genomici per i caratteri considerati. Sono stati confrontati cinque modelli Bayesiani (BayesA, BayesB, BayesC, Bayesian LASSO, Bayesian Ridge Regression) e ne è stata stimata l’accuratezza (in termini di correlazione tra valori osservati e predetti) quando i modelli sono stati utilizzati per predire il fenotipo o l’EBV (estimated breeding value) per mortalità a VNN, livelli di cortisolo, titolo anticorpale o peso, senza però osservare differenze significative tra i modelli. L’accuratezza nel predire gli EBV per la mortalità ha raggiunto valori di 0,89; l’accuratezza nel predire gli EBV ed il fenotipo per i livelli di cortisolo è risultata 0,88 e 0,22, rispettivamente, per il titolo anticorpale 0,76 e 0,26, rispettivamente, per il peso 0,69 e 0,39, rispettivamente. Diverse metriche (area sottesa alla curva ROC, proporzione di risultati corretti sul numero totale di casi, coefficiente di correlazione di Matthew) sono state impiegate per valutare le performance di predizione degli EBV per la mortalità con lo scopo di classificare il fenotipo del carattere stesso, risultando in una migliore performance di classificazione, come indicato dalla metrica AUC, rispetto alla classificazione basata sulle predizioni genomiche del fenotipo. Nel complesso, questi risultati indicano che la predizione genomica potrebbe avere un enorme potenziale per caratteri come la mortalità dovuta a VNN, peso, concentrazione di cortisolo e titolo anticorpale in branzino, utile anche per ridurre la necessità di raccolte periodiche di dati fenotipici e fornendo migliori risultati rispetto agli approcci tradizionali per il miglioramento della resistenza alle patologie. Studi ulteriori su un maggior numero di animali sono comunque indispensabili, così come un approfondimento sulle variazioni nella risposta all’infezione, e quindi nei parametri genetici, dovute ai diversi metodi di infezione usati nei challenge test (immersione, iniezione). Il terzo obiettivo di questo progetto è stato invece rappresentato dallo studio dell’architettura genetica del meccanismo di determinazione del sesso in branzino. Il determinismo sessuale in branzino è un meccanismo poligenico complesso, in quanto risultato dell’interazione tra numerosi geni (con effetto limitato ma aventi azione uguale e cumulativa sul valore fenotipico) e temperatura ambientale. Capire i meccanismi genetici complessi che stanno alla base del determinismo sessuale è comunque interessante anche per una eventuale applicazione in acquacoltura, dal momento che l’alta percentuale di produzione di maschi rispetto alle femmine rappresenta un problema per diversi motivi (i maschi presentano precoce maturazione sessuale osservata in allevamento, con conseguente tasso di crescita inferiore, qualità inferiore del prodotto e, in generale, inferiore valore commerciale rispetto alle femmine). Partendo dal presupposto che un meccanismo di determinazione sessuale poligenico è evolutivamente instabile, l’architettura genetica potrebbe essere differente in popolazioni appartenenti a distinte aree geografiche caratterizzate da condizioni ambientali e termiche diverse. A questo scopo sono stati studiati 927 individui prodotti incrociando riproduttori femmine provenienti dalla zona Ovest del Mar Mediterraneo e riproduttori maschi provenienti da quattro diverse aree geografiche caratterizzate da condizioni ambientali differenti (Nord Atlantico, Ovest Mediterraneo, Nord-Est Mediterraneo e Sud-Est Mediterraneo) e corrispondenti alla distribuzione ed alla struttura genetica delle popolazioni naturali di branzino in Atlantico e Mar Mediterraneo. In generale, la percentuale di femmine nel dataset globale ed entro ciascun gruppo di diversa origine è sempre risultata inferiore rispetto alla percentuale di maschi, con differenze significative tra popolazioni, madri e padri. I valori di ereditabilità per sex tendency, peso e lunghezza (180 giorni post-hatching) sono risultati moderati (h2sex = 0,52 ± 0,17, h2BW = 0,46 ± 0,17, h2BL = 0,34 ± 0,15) e la sex tendency è risultata geneticamente correlata con peso e lunghezza, mostrando valori significativi (ra sex/BW = 0,69 ± 0,12, ra sex/BL = 0,66 ± 0,13). Uno studio di associazione (weighted GWAS) è stato effettuato sia sul dataset globale sia su ciascun gruppo di diversa origine con lo scopo di individuare marcatori SNP potenzialmente associati al determinismo sessuale. Lo studio ha rivelato una diversa architettura genetica per le popolazioni Atlantiche e Mediterranee, ma con affinità per individui appartenenti ad aree geografiche adiacenti, consistenti con l’ipotesi di evoluzione popolazione-specifica del meccanismo di determinazione sessuale in aree caratterizzate da condizioni ambientali differenti.