Role of the protein NapA produced by Borrelia burgdorferi in the pathogenesis of Lyme arthritis

Borrelia burgdorferi è l'agente eziologico della malattia di Lyme. La malattia di Lyme può essere causata da tre specie di Borrelia correlate tra loro: B. burgdorferi, B. afzelii and B. garinii. In Europa la malattia è causata da tutte e tre le specie, mentre, in America, Borrelia burgdorferi è l’unica causa. La malattia di Lyme è una patologia multisistemica e può essere suddivisa in tre stadi: il primo è caratterizzato da un’infezione cutanea localizzata a livello del sito del morso della zecca; nella fase successiva, le spirochete disseminano in diversi tessuti, e l’ultimo stadio è caratterizzato dalla cronicizzazione dell’infezione. La malattia di Lyme ha inizio con una caratteristica lesione cutanea che, nelle ore e giorni successivi al morso, si espande, motivo per cui questo stadio della malattia viene chiamato Eritema migrans. Nelle settimane successive le spirochete disseminano in diversi siti. Dopo mesi, soprattutto nei pazienti che non vengono trattati con terapia antibiotica, l’infezione può cronicizzare causando artrite che colpisce le articolazioni, in particolare le ginocchia (artritie di Lyme). Scopo di questo progetto è quello di contribuire alla comprensione dei meccansimi molecolari e cellulari coinvolti nello sviluppo dell’artrite. E’ oramai stabilito che la risposta immunitaria dell’ospite nei confronti di Borrelia burgdorferi influenza quella che sarà la manifestazione clinica dell’infezione. In particolare, fino a qualche anno fa si riteneva che i linfociti T di tipo Th1, secernenti IFN-, fossero il tipo cellulare principalmente coinvolto nell’artrite di Lyme. Recentemente , utilizzando un modello murino, è stato dimostrato che i linfociti Th1 non erano essenziali nell’indurre l’artrite di Lyme, suggerendo quindi il coinvolgimento di altri tipi cellulari e di mediatoridiversi da IFN- e IL-12 prodotti dalle cellule Th1. L’attenzione si è focalizzata su un nuovo sottotipo di linfociti T helper: i linfociti Th17. E’ riportato che queste cellule giocano un ruolo importante nell’induzione di danno tissutale in malattie autoimmuni attraverso la secrezione di interleuchina (IL)-17. La IL-17 induce il rilascio di varie citochine e chemochine ad attività pro-infiammatoria da parte di cellule stromali, sinoviociti, condrociti, fibroblasti e macrofagi, inoltre, sono in grado di reclutare neutrofili. Un’importante osservazione è costituita dal fatto che la IL-17 si trova a livelli elevati nei liquidi sinoviali di pazienti con artrite di Lyme, dove è in grado di promuovere la formazione di osteoclasti e diverse osservazioni sperimentali suggeriscono che IL-17 possa essere coinvolta nella patogenesi dell’artrite di Lyme. Non era ancora noto, tuttavia, quali fossero i fattori batterici coinvolti nell’induzione di una risposta immunitaria Th17 mediata. In precedenza, nel nostro laboratorio, era stata caratterizzata una proteina prodotta da Helicobacter pylori, batterio che nell’uomo provoca infezione cronica, così come è in grado di fare Borrelia burgdorferi, chiamata HP-NAP (Helicobacter pylori Neutrophil Activating Protein). Si tratta di una proteina fortemente immunogena dotata di specificihe proprietà immunomodulanti. Anche Borrelia possiede una proteina simile ad HP-NAP la cui unica caratterizzazione funzionale aveva portato alla dimostrazione che fosse essenziale per la persistenza della spirocheta nella zecca. Sulla base dell’omologia con HP-NAP abbiamo voluto verificare se anche il prodotto del gene bb0690 di Borrelia e codificante per la proteina NapA potesse giocare un ruolo nello sviluppo dell’artite di Lyme attraverso una specifica modulazione del sistema immunitario. In una prima fase dello studio abbiamo verificato la presenza di anticorpi specifici contro NapA nei sieri di pazienti affetti da artrite di Lyme, mentre, nei pazienti con eritema migrans o paralisi facciale, manifestazioni cliniche che caratterizzano gli stadi precoci della malattia, raramente sono stati trovati anticorpi contro NapA. Successivamente, considerando l’emergente idea che i linfociti Th17 avessero un ruolo cruciale nello sviluppo dell’artrite di Lyme, abbiamo deciso di valutareo il profilo funzionale di linfociti T isolati da pazienti con artrite di Lyme e la eventuale loro specificità verso la proteina NapA. Abbiamo così dimostrato che nella cavità sinoviale di pazienti affetti da artrite di lyme ci sono linfociti Th17 specifici per NapA; inoltre, l’aggiunta della proteina ai suddetti linfociti opportunamente stimolati in vitro, si traduceva nella produzione di IL-17. Sulla base di questi risultati siamo passati a valutare se la capacità di NapA di polarizzare i linfociti T helper verso il profilo Th17, fosse il risultato dell’induzione di un particolare mielieu ricco in IL-6, IL-1, TGF- e IL-23, note citochine che insieme contribuiscono al differenziamento e alla proliferazione dei linfociti Th17. Utilizzando neutrofili e monociti umani come modello sperimentale, in quanto abbondantemente rappresentati nella cavità sinoviale in corso di infiammazione, abbiamo dimostrato che NapA è capace di indurre in queste cellule una maggiore sintesi e rilascio di IL-6, IL-1, TGF- e IL-23. Una forte risposta infiammatoria a Borrelia è una caratteristica di tutti gli stadi della malattia di Lyme. A dare inizio a questa risposta infiammatoria è l’attivazione dell’espressione di geni dovuta al legame delle componenti batteriche ai Toll-like receptors (TLRs). Per tale ragione, al fine di indagare il meccanismo di attivazione dei monociti da parte di NapA, abbiamo considerato la possibilità che questa proteina attivasse un signaling mediato da un TLR. Abbiamo dimostrato che NapA è un ligando del TLR2, e che questo recettore è coinvolto nell’attivazione dei monociti da parte di NapA; questo dato è stato supportato dall’osservazione che l’espressione e produzione di IL-23 veniva abrogata in presenza di un anticorpo specifico bloccante il TLR2. Complessivamente i dati da noi ottenuti hanno dimostrato che NapA è un fattore di virulenza di Borrelia burgdorferi coinvolto nella patogenesi dell’infiammazione Th17 mediata dell’artrite di Lyme (Codolo G. et al., 2008). Sebbene le sequenze di NapA e HP-NAP abbiano il 28% di identità, esse hanno diverse attività immunomodulanti; la prima induce una risposta di tipo Th17, la seconda invece promuove risposte di tipo Th1. L’allineamento tra NapA e HP-NAP ha mostrato che NapA è 13 aminoacidi più lunga all’estremità N-terminale e 20 aminoacidi più lunga all’estremità C-terminale. Sulla base di tali differenze, abbiamo voluto valutare se le proprietà pro-Th17 di NapA risiedessero in queste due porzioni della proteina. Sono state prodotte due proteine mutanti, una priva dei 13 residui all’N-terminale e una senza 20 aminoacidi al C-terminale, e abbiamo valutato le loro proprietà pro-Th17. A tale scopo è stata analizzata l’espressione di IL-6, IL-1, TGF- e IL-23 in monociti trattati con NapA a diversi tempi. Inaspettatamente, le due proteine delete hanno mostrato avere una capacità addirittura maggiore, rispetto a NapA intera, di indurre la sintesi delle citochine prese in esame. Inoltre, siamo andati a vedere se le due proteine mutate fossero ancora in grado di legare il TLR2; per fare questo abbiamo analizzato l’induzione di IL-23 in presenza di uno specifico anticorpo bloccante il TLR2. Abbiamo osservato che la presenza dell’anticorpo bloccante riduce in modo significativo la capacità di NapA e delle due proteine delete la capacità di promuovere la sintesi e il rilascio di IL-23, suggerendo che la porzione di proteina responsabile del legame con il TLR2 e dotata di attività immunomodulante non sia localizzata alle estremità (Codolo G. et al. Submitted). L’artrite di Lyme è caratterizzata dal progressivo danneggiamento dell’articolazione, che è mediato da diversi meccanismi. L’erosione della cartilagine e dell’osso è associata alla formazione del panno sinoviale proliferante. Il processo infiammatorio è caratterizzato dall’infiltrazione di cellule infiammatorie nell’articolazione, che portano alla proliferazione dei sinoviociti simil-fibroblasti (fibroblast-like synoviocytes, FLS), e alla distruzione della cartilagine e dell’osso. L’extravasazione dei neutrofili nell’articolazione è uno dei primi step chiave nello sviluppo dell’infiammazione delle articolazioni, come dimostrato utilizzando un modello murino. La migrazione dei leucociti nella sinovia è un processo multistep finemente regolato che coinvolge l’interazione tra leucociti e cellule endoteliali e le molecole di adesione di superficie, e anche tra leucociti e chemochine e recettori per le chemochine. Il tessuto sinoviale e il liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite di Lyme, così come in altre patologie legate ad artriti croniche, contengono elevate concentrazioni di chemochine. Il sistema delle chemochine si ritiene essere implicato nella patogenesi dell’artrite di Lyme attraverso il reclutamento di neutrofili, monociti e linfociti T nelle articolazioni. L’ultima parte del lavoro che abbiamo svolto aveva lo scopo di capire se NapA fosse in grado di reclutare cellule infiammatorie ed immunitarie. Innanzitutto abbiamo dimostrato, utilizzando un modello di artrite indotta in ratto, che NapA è in grado di reclutare neutrofili e linfociti T capaci di produrre IFN-. Inoltre, abbiamo osservato che la proteina è in grado di indurre aumento dell’espressione di chemochine, quali CCL2, CCL20 e CXCL1, coinvolte nel reclutamento di neutrofili e linfociti T. Tali cellule rappresentano il maggior infiltrato di cellule infiammatorie richiamate a livello delle articolazioni di pazienti affetti da artrite di Lyme. Sulla base dei risultati ottenuti da questi esperimenti, abbiamo voluto capire quale fosse il ruolo di NapA nel reclutamento di neutrofili e linfociti T. Da esperimenti preliminari, abbiamo osservato che la proteina NapA non è in grado, da sola, di reclutare tali cellule. Queste osservazioni suggeriscono che probabilmente NapA non possiede un’attività chemotattica diretta, perciò è possibile ipotizzare che NapA agisca in modo indiretto inducendo la produzione di fattori in grado di richiamare le cellule al sito di infezione. In particolare, sulla base delle chemochine accumulate nella cavità sinoviale dei ratti trattati con NapA, abbiamo ritenuto fosse interessante valutare quali tipi cellulari, attivati da NapA, fossero coinvolti nella produzione di queste chemochine. Abbiamo condotto degli esperimanti preliminari mirati a valutare la produzione di chemochine da parte di macrofagi e neutrofili; sono state scelte queste cellule come modello sperimentale perché i macrofagi sono cellule normalmente residenti in sinovia e quindi in grado, una volta attivati, di produrre molecole pro-infiammatorie coinvolte nel reclutamento di altre cellule al sito di infezione; per quanto riguarda i neutrofili, invece, è noto che essi sono le prime cellule ad essere richiamate in gran numero nella cavità sinoviale di pazienti affetti da artrite di Lyme. Dai primi dati ottenuti, sembra che entrambi i tipi cellulari siano in grado di produrre chemochine responsabili in particolare del reclutamento di neutrofili e linfociti T. Si tratta di un aspetto molto interessante che dovrà essere indagato più in dettaglio. Sembrerebbe che questi dati siano in accordo con quanto riportato da Pellettier e colleghi, che hanno recentemente dimostrato che neutrofili attivati in presenza di IFN- e LPS producono chemochine, quali CCL2 e CCL20, in grado di reclutare linfociti Th17. Inoltre, hanno dimostrato che neutrofili attivati sono in grado di reclutare linfociti Th1 attraverso il rilascio di CXCL10 e CCL2. Un altro interessante aspetto messo in evidenza in questo lavoro, è che i linfociti Th17 possono, a loro volta, richiamare neutrofili attraverso il rilascio di CXCL8. Dunque, come proposto da Pellettier et al., l’interazione tra neutrofili e Th17 potrebbe creare un loop pro-infiammatorio che aumenta il locale accumulo di neutrofili e linfociti T helper in un contesto di malattie infiammatorie. E’ possibile ipotizzare che tale loop si possa verificare anche nella risposta infiammatoria che caratterizza la patogenesi dell’artrite di Lyme. Al fine di verificare questa ipotesi, stiamo facendo esperimenti finalizzati alla valutazione del fenotipo dei linfociti T helper reclutati attraverso l’endotelio, sotto lo stimolo di supernatanti di coltura che derivano da neutrofili o macrofagi stimolati con NapA.