Drosophila Marf is the evolutionary ancestor of mammalian Mfn2: a phylogenetic analysis

I mitocondri sono organelli essenziali per l’omeostasi cellulare. La loro funzione primaria è di produrre energia : la respirazione mitocondriale fornisce la maggior parte di ATP necessaria per le reazioni endoergoniche. Inoltre, essi regolano i livelli e i transienti di calcio citosolico e hanno un ruolo cruciale nei processi di apoptosi, invecchiamento e stress ossidativo (Jouaville et al., 1995; Wang, 2001). Il 20% della superficie mitocondriale è in stretto contatto con il reticolo endoplasmico (RE). Questa disposizione è importante per la generazione di microdomini ad alta concentrazione di calcio necessari in certe condizioni per l’attivazione dell’uniporto mitocondriale del Ca2+. I siti di stretto contatto tra il RE e i mitocondri formano le cosiddette “membrane associate ai mitocondri” (MAMs), che sono cruciali per il trasporto di lipidi e Ca2+ tra i due organelli e hanno un ruolo anche nel processo di morte cellulare (Rizzuto et al., 1998). Sebbene i meccanismi molecolari alla base di questa stretta vicinanza tra il RE e i mitocondri siano in larga parte ignoti, si ritiene che tale interazione possa essere regolata da cambiamenti morfologici dei due organelli (Pitt set al., 1999; Simmen et al., 2005). La forma del reticolo mitocondriale è determinata dall’equilibrio tra eventi di fusione e fissione, controllati da una famiglia di “proteine di morfologia mitocondriale”. In cellule di mammifero, la fusione mitocondriale è controllata dalle proteine mitofusina-1 (MFN1) e mitofusina-2 (MFN2) nella membrana esterna e da OPA1 nella membrana mitocondriale interna (Olichon et al., 2002). Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che OPA1 promuove la fusione dei mitocondri solo in presenza di mitofusina 1 (Cipolat et al., 2004). La fissione richiede il passaggio aggiuntivo della traslocazione della proteina Drp1 dal citosol ai mitocondri, dove si ancora a hFis1, il suo adattatore molecolare nella OMM. L’oligomerizzazione di Drp1 fornisce la forza meccanica per costringere le membrane mitocondriali fino alla frammentazione dell’organello (Hinshaw et al., 1999; Smirnova et al., 2001). La traslocazione di Drp1 ai mitocondri dipende dalla sua defosforilazione ad opera della fosfatasi calcineurina e di altre fosfatasi (Cereghetti et al., 2008). Le mitofusine sono GTPasi appartenenti alla famiglia delle dinamine che controllano la fusione e la morfologia dei mitocondri. In passato, la presenza di due mitofusine nei mammmiferi ha sollevato la questione sulla loro divergenza funzionale. Oggi molti risultati supportano l'idea che Mfn1 e 2 non abbiano funzioni ridondanti. Mfn2 ha ruoli che Mfn1 non esercita, come il controllo dei processi di ossidazione mediati dai mitocondri (Bach et al., 2005) e la funzione anti-proliferativa (Chen et al., 2004). Inoltre, mentre la fusione mitocondriale indotta dalla proteina della membrana interna OPA1 richiede Mfn1, (Cipolat et al., 2004), Mfn2 sembra essere coinvolta nella regolazione della giustapposizione reticolo endoplasmatico (RE)-mitocondri (de Brito e Scorrano, 2008a). MFN2 è stata associata inoltre alla neuropatia di Charcot-Marie-Tooth di tipo IIa (CMTIIa) (Züchner et al., 2004b). Sia Mfn1 e Mfn2 sono essenziali per lo sviluppo embrionale e topi deficienti in entrambi muoiono prematuramente, ma (Chen et al, 2003) embrioni Mfn2-/- mostrano anche difetti di placentazione. Tuttavia, l'ablazione post-placentazione di una singola Mfn nel topo porta a due fenotipi completamente diversi: i topi Mfn1-/ - sono vitali, mentre topi Mfn2-/ - muoiono tra P1 e P17 come conseguenza della massiccia degenerazione cerebellare (Chen et al. , 2007). Non è chiaro se i diversi fenotipi osservati in vivo e in vitro possano essere attribuiti a differenze funzionali o semplicemente ai diversi schemi di espressione delle due Mfn. Inoltre, tutti i vertebrati possiedono due Mfn, mentre solo una Mfn viene riscontrata nella maggior parte degli invertebrati, con l'eccezione di D.melanogaster. Il moscerino della frutta possiede due mitofusine, ‘Fuzzy onion’ (Fzo) e Mitochondrial Assembly Regulatory Factor (Marf). Fzo è stato il primo mediatore della fusione mitocondriale individuato (Hales e Fuller, 1997). In spermatociti Fzo media la fusione dei mitocondri in due giganti organelli che formano una struttura chiamata Nebenkern, la quale serve a dare energia al flagello degli spermatidi. Nel mutante di fzo i mitocondri non riescono a fondersi e si avvolgono l'un l'altro come molti organelli frammentati, dando l'impressione di 'cipolle increspate' se osservate al microscopio elettronico. Anche se Fzo è in grado di promuovere l'allungamento mitocondriale, è espresso solo negli spermatidi. Ciò ha sollevato la questione di come la fusione dei mitocondri potesse venire regolata in altri tessuti del moscerino della frutta. Nel 2002 il secondo omologo delle mitofusine Marf è stato identificato in D.melanogaster (Hwa et al., 2002). A differenza di Fzo, DMarf è espressa ubiquitariamente e condivide il 64% di omologia con entrambe le mitofusine dei mammiferi. Quindi, Marf può essere considerato la singola mitofusina "funzionale" e Drosophila melanogaster è dunque un organismo modello utile per studiare la filogenesi di MFN nei vertebrati superiori. Le domande a cui abbiamo cercato di dare risposta in questa tesi sono le seguenti: questo organismo modello rappresenta il punto di svolta evolutiva da uno a due mitofusine? Quale Mfn è funzionalmente più vicina a DMarf? Al fine di rispondere a queste domande, abbiamo innanzitutto cercato di capire in quale estensione DMarf potesse complementare le mitofusine dei mammiferi. Per ottenere una visione più ampia dal punto di vista filogenetico, abbiamo esteso la nostra analisi alle mitofusine 1 e 2 del vertebrato Xenopus laevis (XMfn1 e XMfn2) e all’omologo di mitofusina di lievito S.cerevisae (Fzo1p). L'espressione di Fzo1p, DMarf, XMfn1 e XMfn2, induce allungamento dei mitocondri in Mfn1-/ - o Mfn2-/ - MEF, recuperando il fenotipo di frammentazione causato dalla mancanza delle singole Mfn e indicando che esse possono sostituire entrambe le Mfn. A differenza di Mfn1-/ - MEF, Mfn2-/ - MEF mostrano una morfologia del reticolo endoplasmico alterata (de Brito e Scorrano, 2008b). Questo difetto è recuperato solo dopo l'espressione di hMfn2 o di una variante hMfn2 specificamente localizzata al RE (hMfn2YFFT), indipendentemente dalla forma mitocondriale. Mfn2 infatti è parzialmente localizzata nel RE e si trova arricchita nelle MAMs. Per capire se DMarf potesse complementare Mfn2 anche nella regolazione della morfologia del RE, abbiamo co-trasfettato Mfn2-/ - MEFs con Dmarf con il tag V5 e una proteina fluorescente gialla localizzata nel RE (ERYFP). DMarf riesce a recuperare la morfologia del RE in Mfn2-/ -, mostrando quindi una più forte conservazione funzionale con Mfn2. Abbiamo poi rivolto la nostra attenzione ad un analisi in vivo della funzione di DMarf in Drosophila. DMarf è essenziale per la vitalità, poichè il silenziamento ubiquitario o specificatamente a carico del sistema nervoso o del tessuto muscolare della proteina è letale. In larve DMarf-RNAi i mitocondri si aggregano nelle regioni perinucleari dei corpi cellulari neuronali e dei tessuti muscolari. Inoltre, giunzioni neuromuscolari degli individui DMarf-RNAi risultano gravemente depauperati dei mitocondri rispetto alle larve di controllo. Dato che mitofusina-2 regola la morfologia del reticolo endoplasmico e il suo avvicinamento ai mitocondri, abbiamo studiato l’effetto del silenziamento di Dmarf sull’architettura del RE, la quale è risultata essere seriamente compromessa nei tessuti muscolari mostrando perdita dell’organizzazione del RE lungo i sarcomeri in seguito al silenziamento della proteina. Per studiare l'effetto della sovraespressione di hMfn in Drosophila, abbiamo caratterizzato le linee transgeniche esprimenti hMfn1, hMfn2 e hMfn2R94Q, una delle mutazioni più frequenti associate al CMT2A (Züchner et al., 2004a). Aggregazione dei mitocondri in corpi cellulari neuronali e nel muscolo e organelli di forma allungata o aggregati all'interno di assoni sono stati osservati in seguito a sovraespressione di tutte le hMfns. Tuttavia, l'analisi delle giunzioni neuromuscolari ha rivelato una grande differenza tra le espressioni hMfn1, hMfn2 e hMfn2R94Q: mentre le giunzioni di individui sovraesprimenti hMfn2 e hMfn2R94Q erano depauperate dei mitocondri, l’espressione di hMfn1 non ha modificato la distribuzione degli organelli nel sistema nervoso e mitocondri erano mantenuti all'interno delle giunzioni. L’organizzazione del RE nel muscolo non è stata influenzata dall’espressione di hMfns wild-type; la morfologia del RE è invece alterata in tessuti muscolari di individui esprimenti hMfn2R94Q, mettendo in luce un aspetto non ancora indagato nello studio della patogenesi di Charcot-Marie-Tooth e suggerendo l'alterazione della morfologia del RE come uno dei plausibili fattori che possono contribuire alla patogenesi della malattia. Dato che DMarf è stato in grado di complementare sia entrambe le Mfn nella morfologia mitocondriale e sia Mfn2 nella regolazione della morfologia del RE, abbiamo cercato di capire in che misura hMfn1 e -2 potessero complementare DMarf in Drosophila. L'espressione simultanea dei transgeni MFN2 e DMarf-RNAi nel sistema nervoso o nel tessuto muscolare provocano parziale sopravvivenza fino all'età adulta, mentre Mfn1 o Mfn2R94Q non sono riusciti a recuperare il fenotipo letale del DMarf-RNAi. Tuttavia, gli aggregati mitocondriali erano ancora presenti nei corpi delle cellule neuronali e nei tessuti muscolari e le giunzioni neuromuscolari di individui esprimenti contemporaneamente DMarf-RNAi e hMfn2 prive di mitocondri. Quindi, anche se MFN2 recupera la letalità dovuta al silenziamento di DMarf, questo non può essere attribuito a un recupero della morfologia e della distribuzione mitocondriale. Abbiamo quindi valutato il recupero dell’organizzazione del RE in individui esprimenti simultaneamente Dmarf-RNAi e hMfn. HMfn1 non ha avuto alcun effetto sull’ alterazione del RE causata da Dmarf-RNAi. Al contrario, hMfn2 espressione ha recuperato l’architettura del RE nel muscolo sia quando espressa ubiquitariamente o solo nel tessuto muscolare. In conclusione, in questa tesi abbiamo dimostrato che l’ espressione di Fzo1p, DMarf, XMfn1 e XMfn2 è in grado di recuperare la morfologia mitocondriale in Mfn1 - / - e Mfn2-/ - MEF. Inoltre DMarf complementa specificamente la morfologia del RE in Mfn2-/ - MEF. Quindi, il ruolo delle mitofusine nella regolazione della dinamica mitocondriale è conservato tra vertebrati e invertebrati. Tuttavia, esperimenti in vivo dimostrano che Mfn2, ma non Mfn1 recupera il fenotipo letale dovuto al silenziamento di DMarf in Drosophila melanogaster. Il recupero di DMarf-RNAi da parte di hMfn2 sembra correlare con la correzione dell’ organizzazione del RE, mentre la morfologia mitocondriale e la distribuzione non sono vengono ripristinati. Possiamo quindi ipotizzare che Marf sia funzionalmente più vicina ai Mfn2 rispetto a Mfn1, la quale potrebbe essere comparsa più tardi nel corso dell'evoluzione dei mammiferi. Infine, altri fattori,oltre l’alterazione della morfologia e distribuzione mitocondriale nel sistema nervoso potrebbero spiegare la letalità causata dal silenziamento di DMarf e essere quindi coinvolti nella patogenesi della CMT2A.