Ingegnerizzazione della proteina di matrice M1 del virus dell'influenza per la produzione di virus-like particles (VLPs) a scopo vaccinale

I virus dell’influenza costituiscono un rilevante problema di sanità pubblica a livello mondiale, in quanto sono gli agenti eziologici di patologie respiratorie acute che si possono presentare sotto forma di epidemie annuali, oppure come pandemie occasionali. Questi virus evolvono costantemente mediante l’accumulo di mutazioni puntiformi a carico degli antigeni di superficie emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) (antigenic drift), oppure in seguito a fenomeni di riassortimento genico (antigenic shift) derivanti dalla coinfezione di virus aviari ed umani in un ospite intermedio. L’alto tasso di mutazioni, la possibilità di riassortimento dei segmenti genici e l’ampia varietà di virus dell’influenza spiegano la capacità di questi virus di superare le barriere anticorpali indotte da immunità pregresse (Wong et al., 2005). Inoltre, l’alta variabilità del virus dell’influenza limita anche l’efficacia della terapia antivirale a disposizione a causa dei frequenti fenomeni di farmaco-resistenza. La vaccinazione rappresenta, quindi, la miglior strategia per prevenire e ridurre le possibilità di infezione da parte del virus dell’influenza e le conseguenti complicazioni. Tuttavia, le strategie per lo sviluppo di vaccini efficaci, capaci di stimolare immunità di lunga durata, sono risultate vane ad oggi, determinando quindi la necessità di cambiare ogni anno la formulazione del vaccino influenzale (Wong et al., 2005). Per questo motivo, sono allo studio nuovi approcci vaccinali che consentano di ottenere, una volta inoculati nell’uomo, una protezione prolungata e diretta contro diversi sottotipi influenzali (vaccini universali). Inoltre, si cerca di migliorare l’efficacia e la rapidità delle procedure produttive dei vaccini classici, in maniera da poter affrontare, se necessario, emergenze quali l’insorgenza di ceppi influenzali pandemici (Kang et al., 2011). Una tecnica molto promettente, da entrambi i punti di vista, risulta essere quella basata sulla produzione di particelle simil-virali o Virus-like particles (VLP). Le VLP mimano strutturalmente la particella virale, ma mancano della capacità replicativa, poichè prive del genoma virale (Zeltins, 2013). Le particelle simil-virali possono essere ottenute mediante l’espressione delle proteine strutturali virali (es.: Gag dei retrovirus, L1 di HPV), le quali hanno la capacità intrinseca di autoassemblarsi e gemmare dalle cellule (Haynes, 2009). Inoltre, le VLP posso essere utilizzate anche come piattaforme per la presentazione di epitopi, anche eterologhi, immunodominanti. La proteina di matrice M1 rappresenta la driving force della fase di gemmazione del virus dell’influenza (Gomez-Puertas et al., 2000). La sua espressione nelle cellule, tuttavia, non è sufficiente a determinare la produzione di VLP. Questo dipende da diverse ragioni, tra le quali l’incapacità di M1 di contattare da sola la membrana plasmatica, a causa della mancanza di un segnale specifico di indirizzamento (Wang et al., 2010a). A questo proposito, è stato dimostrato come un’altra proteina strutturale virale, M2, svolga un ruolo importante nelle ultime fasi del processo di gemmazione virale, mediando proprio l’interazione tra M1 e la membrana plasmatica (Chen et al., 2008). Inoltre, è stato recentemente chiarito che la capacità del virus dell’influenza di gemmare dalle cellule infettate in assenza del pathway di biogenesi dei Multivescicular Bodies (MVB), funzionale, utilizzato invece dalla maggior parte dei virus ad RNA dotati di envelope, sia da ascrivere proprio a funzioni intrinseche di M2. In particolare, M2 sarebbe in grado di funzionare come sostituto delle proteine appartenenti al complesso ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-III, fondamentale nell’ambito della formazione dei MVB e nella gemmazione di molti virus a RNA (Rossman et al., 2010). Scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di conferire ad M1 le minime caratteristiche necessarie per gemmare da cellule eucariotiche anche in assenza di altri componenti virali. A tale scopo, M1 è stata opportunamente ingegnerizzata attraverso la fusione di domini, porzioni o intere proteine eterologhe, al fine di conferirle la capacità di contattare autonomamente la membrana cellulare e di sfruttare ESCRT-III. Il presente lavoro di dottorato si propone quindi l’ottimizzazione della produzione di VLP del virus dell’influenza come piattaforma per lo sviluppo di un vaccino universale. In particolare, l’attenzione è stata focalizzata sulla proteina di matrice M1 e sulla possibilità di renderla indipendente dalla proteina M2 durante la fase di gemmazione. È stato possibile quindi dimostrare: i) che il segnale di miristilazione della proteina Gag del virus dell’immunodeficienza umana (HIV-1), fuso nella regione amminoterminale di M1 (Myr-M1), le conferisce la capacità di contattare la membrana plasmatica, ii) che l’aggiunta di un piccolo dominio ricco in prolina (PTAP), noto in letteratura come in grado di mediare l’interazione tra proteine diverse e il pathway di biogenesi dei MVB, consente ad Myr-M1 di gemmare nel sovratante cellulare; iii) che la fusione tra M1 e la proteina cellulare CHMP4B, appartenente al complesso ESCRT-III consente ad M1 di fuoriuscire dalle cellule, indipendentemente dalla presenza del segnale di miristilazione. Inoltre, abbiamo dimostrato che la proteina di fusione M2-M1 è in grado di gemmare autonomamente dalle cellule, così come la sola M2. Infine, le VLP basate su M2, M2-M1 e Myr-M1-CHMP4B sono state utilizzate in un esperimento pilota, eseguito nel topo, al fine di analizzarne l’immunogenicità in vivo. Nonostante siano stati rilevati anticorpi specifici e diretti contro la proteina M1 in un numero statisticamente non significativo di topi saggiati, i dati ottenuti in questo esperimento pilota risultano essere incoraggianti. Infatti, sono stati raggiunti utilizzando VLP prodotte in condizioni di purificazione ancora da ottimizzare. Partendo da questi dati, abbiamo anche generato una serie di costrutti codificanti diversi mutanti della proteina di superficie del virus influenzale HA, accomunati dall’assenza di uno dei suoi domini, ovvero dalla parte globulare (HA-headless). E’ stato, infatti, dimostrato che HA-headless, a differenza della forma wild-type della proteina, è caratterizzata dall’esposizione al sistema immunitario di epitopi altamente conservati e, quindi, rappresenta un’ottima base per lo sviluppo di un vaccino universale, in grado di stimolare la risposta immunitaria verso ceppi virali diversi. Abbiamo analizzato e dimostrato la possibilità di incorporare HAheadless in particelle simil-virali basate sull’espressione della proteina Gag del virus dell’immunodeficienza felina (FIV). Intendiamo ora valutare la possibilità di incorporare HA-headless anche nelle VLP basate su M1 ingegnerizzata e, dopo opportuna purificazione, testare queste ultime e le VLP basate su FIV nel modello murino. In ultimo, al fine di approfondire il ruolo svolto da M2 come sostituta di ESCRT-III nell’ambito della gemmazione del virus dell’influenza, sono stati generati costrutti specifici basati sulla proteina strutturale Gag di FIV, mutata a livello delle sequenze che il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato essere essenziali per il reclutamento del pathway di biogenesi degli MVB e per la gemmazione di FIV (Calistri et al., 2009a). I risultati ottenuti suggeriscono che la regione della coda citoplasmatica di M2 è in grado di ripristinare la gemmazione dei mutanti virali. In conclusione, i dati ottenuti in questa tesi di dottorato non solo forniscono importanti informazioni biologiche, relative alle funzioni di due proteine del virus dell’influenza (M1 e M2) e del coinvolgimento di proteine cellulari in fasi essenziali del ciclo replicativo virale, ma pongono interessanti basi per lo sviluppo di nuove strategie vaccinali dirette contro il virus dell’influenza basate su VLP.