Realizzazione multistep di neo-costrutti epatici con apporto vascolare attraverso tecniche di tissue engineering

INTRODUZIONE: Il progetto oggetto di questa tesi si è proposto di applicare le tecniche di ingegneria tissutale come approccio alla realizzazione di costrutti epatici per il supporto metabolico delle malattie del fegato; la realizzazione del lavoro si è sviluppata attraverso la successione multistep di diversi progetti tra loro complementari. L’ingegnerizzazione di tessuto epatico attraverso colture di epatociti primari infatti offre nuove prospettive in questo ambito; tuttavia la realizzazione di strutture 3D è spesso limitata dalla mancanza di una struttura vascolare in grado di costituire un adeguato supporto nutritivo. D’altra parte gli epatociti sono cellule ad alto metabolismo e la loro sopravvivenza è limitata in condizioni ipossiche, in mancanza di una sufficiente rete vascolare. Al fine di superare questo problema e di ottimizzare le condizioni per il supporto di nutrienti, abbiamo innanzi tutto rivolto l’attenzione alla realizzazione di un bioreattore bilayer, sviluppato nelle 2 dimensioni, e ingegnerizzato partendo da dati noti di microfluidodinamica; inoltre in grado di proporre un sistema di coltura basato sulla anatomia microscopica del fegato. Tale design ha permesso la realizzazione di un bioreattore in grado di costituire una piattaforma da utilizzare come unità di drugtesting, ma anche per la successiva realizzazione di un sistema di assistenza epatica (progetto 1). Sulla base dei dati ottenuti, il progetto è stato in seguito traslato nel modello in vivo e il bioreattore è stato testato nel piccolo animale; l’impianto del device è stato realizzato ex vivo mediante il confezionamento di uno shunt artero-venoso femoro-femorale (progetto 2). Il lavoro è stato quindi implementato sviluppando sistemi di coltura nelle 3 dimensioni (progetto 3); diverse combinazioni di coltura su scaffolds 3D in perfusione continua, all’interno di nuovi bioreattori, sono state testate per l’induzione differenziativa di cellule staminali (precursori epatocitari di origine umana). I successi ottenuti hanno spinto alla realizzazione dell’ultimo step (progetto 4). Smart scaffolds 3D di nuova generazione sono stati utilizzati per allestire colture 3D attraverso diverse combinazioni di popolazioni cellulari (epatociti primari + cellule mesenchimali staminali o soli epatociti primari), inducendo processi di neoangiogenesi. Dopo adeguato preconditioning in bioreattori in vitro, lo scaffold è stato in seguito impiantato in vivo, nel piccolo animale. METODI: Progetto 1: 18 bioreattori ingegnerizzati a flusso continuo sono stati testati per la loro capacità di trasporto di metaboliti all’interno di un compartimento parenchimale ove le colture cellulari sono state protette dagli effetti nocivi di shear stress. I bioreattori sono stati sottoposti a semina con cellule HepG2/C3A ed epatociti primari in diverse condizioni di coltura, al fine di testare la capacità del sistema di mantenere in vitro una coltura dinamica, vitale ed efficiente dal punto di vista metabolico. Progetto 2: 16 bioreattori (precedentemente ingegnerizzati nel progetto 1) sono stati utilizzati e sottoposti a coltura con epatociti primari e 12 con cellule umane HepG2/C3A; i bioreattori sono stati impiantati ex vivo in ratti atimici attraverso la realizzazione di uno shunt artero-venoso femoro-femorale. Il setting del bioreattore exvivo ha previsto diverse configurazioni, testate sotto il profilo dei parametri di vitalità cellulare sulla base dei relativi dati di pressione e di flusso nelle diverse configurazioni. Il pattern di flusso ematico e la perfusione del sistema sono stati esaminati attraverso laser Doppler scanning. La vitalità cellulare e la funzionalità metabolica sono state inoltre verificate. Progetto 3: una popolazione di Pluripotent Human Liver Stem Cells (HLSCs) è stata coltivata su 18 "smart scaffolds" 3D, composti da spugne di collagene biocompatibile. Lo scaffold è stato inserito in un nuovo bioreattore per la perfusione di strutture 3D in grado di garantire flussi uniformi di medium; medium per cellule staminali e colture miste con cellule stellate del fegato (HSCs) sono state aggiunte in diverse condizioni di coltura. Le diverse combinazioni sono state testate attraverso l’esecuzione di studi morfologici e funzionali rispettivamente nei giorni 3, 5 e 7 della perfusione in vitro. Project 4: 12 scaffolds 3D, costituiti da un derivato dell’acido ialuronico [a benzyl ester of hyaluronan (HYAFF®) sono stati sottoposti a semina con popolazioni di cellule staminali mesenchimali di origine umana (HMSCs) ed epatociti in diverse combinazioni; è stata allestita una coltura in perfusione continua nel bioreattore precedentemente descritto (preconditioning). In seguito gli scaffolds sono stati impiantati nell’omento di 12 ratti atimici, costituendo una tasca “rolled” 3D. Studi morfologici sono stati eseguiti al fine di valutare i processi di neoangiogenesis sostenuti dalle cellule HMSCs e valutare la vitalità epatocitarie a 7 giorni dall’impianto. RISULTATI: Progetto 1: Il bioreattore ingegnerizzato si è dimostrato in grado di sostenere entrambe le popolazioni cellulari in studio, comprese colture primarie di epatociti (notoriamente più sensibili), attraverso la realizzazione di una perfusione continua di medium sovrapponibile a flussi fisiologici. Tale circostanza ha favorito sia i processi di proliferazione cellulare che la funzione metabolica epatocitaria (sintesi proteica). Il modello matematico del sistema ha permesso di sostenere una coltura dinamica fino a 14 giorni. Progetto 2: Il bioreattore, collegato all’animale attraverso il confezionamento di uno shunt femorale artero-venoso, ha realizzato un sistema di perfusione ex vivo. Il flusso ematico all’interno del network vascolare si è dimostrato omogeneo nel tempo ed ha ricostituito il fisiologico pattern di flusso artero-venoso del fegato. La sopravvivenza cellulare ha dimostrato alti valori dipendentemente dai valori pressori raggiunti all’interno della camera parenchimale. La configurazione del sistema che ha generato la minore pressione all’interno della camera parenchimale ha dimostrato anche i migliori risultati in termini di sopravvivenza cellulare. Progetto 3: con l’intenzione di costituire strutture 3D, la differenziazione epatica di cellule HLSCs da fegato umano è stata indotta in scaffolds di collagene; i test morfologici e gli assays funzionali hanno confermato la maturazione. Il flusso continuo di perfusione del medium (garantito dal bioreattore) ha favorito in vitro la distribuzione delle cellule in clusters organizzati fino alle porzioni più profonde dello scaffold. Gli esperimenti hanno dimostrato che la spugna di collagene e le condizioni di coltura dinamica in vitro sono in grado di promuovere non solo la formazione di aggregati di HLSCs ma anche di favorire una più rapida maturazione verso fenotipi epatici maturi. Progetto 4: lo step finale, ancora in corso, ha previsto l’induzione della neoangiogenesi in vivo. Dopo un processo di preconditioning della coltura cellulare nel bioreattore precedentemente ingegnerizzato (progetto 3), scaffolds 3D di HYAFF® con combinazioni diverse di epatociti primari e MSCs, sono stati impiantati nei ratti. Il costrutto cosi ottenuto a 7 giorni dall’impianto ha dimostrato, alla immunofluorescenza, la formazione di iniziali clusters in cui si sono identificati eventi neoangiogenetici con formazione di strutture simil-vascolari. Gli epatociti sono sopravissuti durante tutto il periodo di studio; positiva la ricerca, alla immunofluorescenza, per albumina, CK8-18- 19. Le strutture vascolari, identificate dapprima con colorazione EE, si sono dimostrate positive alla immunofluorescenza per il fattore di von Willebrand. I dati sono suggestivi per ulteriori studi nell’ambito dei processi di neoangiogenesi. CONCLUSIONI: Gli approcci preliminari ci hanno permesso di raggiungere e ottenere in vivo risultati promettenti nella ricostituzione di costrutti epatici caratterizzati da processi neoangiogenetici, partendo da semplici layers 2D. I risultati sono suggestivi per sviluppi futuri di ingegnerizzazione di organoidi epatici.