RIASSUNTO Il DNA mitocondriale ha una trasmissione matrilineare ed ogni cellula contiene tra le 500 e le 10000 molecole di mtDNA. Le mutazioni patologiche dell’mtDNA umano sono conosciute da numerosi anni ed è noto che le molecole di DNA mitocondriale mutato e wild-type coesistono all’interno della stessa cellula, condizione nota come eteroplasmia. La mutazione puntiforme più comune è la mutazione A3243G nel gene tRNA Leu(UUR) del DNA mitocondriale umano ed è associata alla sindrome MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes). In che modo le mutazioni dannose dell’mtDNA si stabilizzino, e come crescano e diminuiscano con il passare del tempo sono argomenti di grande interesse e che richiedono ancora notevole studio. Diversi articoli suggeriscono che il DNA mitocondriale mutato si fissa solamente attraverso un processo stocastico. Comunque studi recenti condotti su topo hanno dimostrato che a livello germinale vi è una purificazione, un processo selettivo, per eliminare le varianti dannose. Ed un altro studio un altro ha evidenziato che la distribuzione della mutazione A3243G nell’mtDNA di pazienti affetti da malattia mitocondriale non era casuale. C’è quindi una forte evidenza che la quantità di mutazione non è solamente determinata da un processo casuale di deriva genetica. La segregazione e la trasmissione dell’mtDNA sono dipendenti dai movimenti mitocondriali e dalla loro eliminazione. Anche in cellule che non si dividono i mitocondri sono organelli dinamici che sottostanno ad eventi di fissione e fusione; essi oscillano da una struttura piccola e sferica ad una complessa rete interconnessa. L’estensione di questa rete dipende dall’equilibrio tra elongazione e frammentazione dei mitocondri. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che perturbando l’equilibrio tra la fissione e la fusione mitocondriale viene influenzata la segregazione dell’mtDNA wild-type e mutato, suggerendo che i livelli di DNA mitocondriale wild-type e mutato possono essere manipolati dall’alterazione dell’espressione di fattori nucleari codificanti per proteine coinvolte nella fissione e nel controllo di qualità mitocondriale (mtQC). Lo studio ha avuto come obbiettivi: i) chiarificare la relazione tra la segregazione dell’mtDNA mutato e la dinamica mitocondriale grazie alla manipolazione della fusione mitocondriale silenziando geneticamente Mitofusina1 e ii) studiare il macchinario autofagico e la mitofagia in cellule con una diversa percentuale di mutazione MELAS dell’mtDNA: cibridi di polmone (0%, 35%, 70% e 99% mutati) e cibridi di muscolo (0%, 70%, 80% e 99% mutati). Poiché i cibridi di polmone (A549 adenocarcinoma polmonare) favoriscono l’mtDNA wild-type e i cibridi di muscolo (RD rabdomiosarcoma) favoriscono il DNA mitocondriale mutato. In questo lavoro abbiamo ottenuto la down regolazione di Mfn1 in sei cloni di cibridi RD con l’80% di mutazione utilizzando la tecnica dell’RNAi. In questi cloni non è stato osservato un decremento delle molecole di mtDNA mutate. L’autofagia è stata analizzata quantificando l’espressione genica e la quantità di proteina dei principali markers quali: p62 e LC3. Abbiamo scoperto che entrambe le proteine sono presenti nelle due linee cellulari con mutazione A3243G dell’ mtDNA e diverso background nucleare, indicando che vi è una buona “auto pulizia” in entrambe le linee cellulari e che non vi sono differenze legate al background nucleare. Abbiamo analizzato anche l’eliminazione specifica dei mitocondri danneggiati, mitofagia, quantificando l’espressione genica e i livelli di proteina di tre markers mitofagici: PINK1, Parkin e BNIP3. Inoltre sono state condotte analisi morfologiche, biochimiche e molecolari sempre per valutare sia l’autofagia che la mitofagia. Tutti i dati dimostrano che nei cibridi di polmone la mitofagia aumenta con l’aumentare del DNA mitocondriale mutato, indicando che vi è una attiva rimozione dei mitocondri danneggiati. Interessante è notare che nei cibridi muscolari si verifica l’opposto: la mitofagia diminuisce all’aumentare della percentuale di mutazione. Questi dati ci spiegano perchè nei cibridi con background muscolare viene favorito il DNA mitocondriale mutato, e mostrano come possibile causa di questo comportamento la presenza di una mitofagia alterata e meno efficiente rispetto a quella dei cibridi con background polmonare.

Ruolo dell'autofagia e della dinamica mitocondriale nella segregazione del DNA mitocondriale

BETTIO, SARA
2014

Abstract

RIASSUNTO Il DNA mitocondriale ha una trasmissione matrilineare ed ogni cellula contiene tra le 500 e le 10000 molecole di mtDNA. Le mutazioni patologiche dell’mtDNA umano sono conosciute da numerosi anni ed è noto che le molecole di DNA mitocondriale mutato e wild-type coesistono all’interno della stessa cellula, condizione nota come eteroplasmia. La mutazione puntiforme più comune è la mutazione A3243G nel gene tRNA Leu(UUR) del DNA mitocondriale umano ed è associata alla sindrome MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes). In che modo le mutazioni dannose dell’mtDNA si stabilizzino, e come crescano e diminuiscano con il passare del tempo sono argomenti di grande interesse e che richiedono ancora notevole studio. Diversi articoli suggeriscono che il DNA mitocondriale mutato si fissa solamente attraverso un processo stocastico. Comunque studi recenti condotti su topo hanno dimostrato che a livello germinale vi è una purificazione, un processo selettivo, per eliminare le varianti dannose. Ed un altro studio un altro ha evidenziato che la distribuzione della mutazione A3243G nell’mtDNA di pazienti affetti da malattia mitocondriale non era casuale. C’è quindi una forte evidenza che la quantità di mutazione non è solamente determinata da un processo casuale di deriva genetica. La segregazione e la trasmissione dell’mtDNA sono dipendenti dai movimenti mitocondriali e dalla loro eliminazione. Anche in cellule che non si dividono i mitocondri sono organelli dinamici che sottostanno ad eventi di fissione e fusione; essi oscillano da una struttura piccola e sferica ad una complessa rete interconnessa. L’estensione di questa rete dipende dall’equilibrio tra elongazione e frammentazione dei mitocondri. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che perturbando l’equilibrio tra la fissione e la fusione mitocondriale viene influenzata la segregazione dell’mtDNA wild-type e mutato, suggerendo che i livelli di DNA mitocondriale wild-type e mutato possono essere manipolati dall’alterazione dell’espressione di fattori nucleari codificanti per proteine coinvolte nella fissione e nel controllo di qualità mitocondriale (mtQC). Lo studio ha avuto come obbiettivi: i) chiarificare la relazione tra la segregazione dell’mtDNA mutato e la dinamica mitocondriale grazie alla manipolazione della fusione mitocondriale silenziando geneticamente Mitofusina1 e ii) studiare il macchinario autofagico e la mitofagia in cellule con una diversa percentuale di mutazione MELAS dell’mtDNA: cibridi di polmone (0%, 35%, 70% e 99% mutati) e cibridi di muscolo (0%, 70%, 80% e 99% mutati). Poiché i cibridi di polmone (A549 adenocarcinoma polmonare) favoriscono l’mtDNA wild-type e i cibridi di muscolo (RD rabdomiosarcoma) favoriscono il DNA mitocondriale mutato. In questo lavoro abbiamo ottenuto la down regolazione di Mfn1 in sei cloni di cibridi RD con l’80% di mutazione utilizzando la tecnica dell’RNAi. In questi cloni non è stato osservato un decremento delle molecole di mtDNA mutate. L’autofagia è stata analizzata quantificando l’espressione genica e la quantità di proteina dei principali markers quali: p62 e LC3. Abbiamo scoperto che entrambe le proteine sono presenti nelle due linee cellulari con mutazione A3243G dell’ mtDNA e diverso background nucleare, indicando che vi è una buona “auto pulizia” in entrambe le linee cellulari e che non vi sono differenze legate al background nucleare. Abbiamo analizzato anche l’eliminazione specifica dei mitocondri danneggiati, mitofagia, quantificando l’espressione genica e i livelli di proteina di tre markers mitofagici: PINK1, Parkin e BNIP3. Inoltre sono state condotte analisi morfologiche, biochimiche e molecolari sempre per valutare sia l’autofagia che la mitofagia. Tutti i dati dimostrano che nei cibridi di polmone la mitofagia aumenta con l’aumentare del DNA mitocondriale mutato, indicando che vi è una attiva rimozione dei mitocondri danneggiati. Interessante è notare che nei cibridi muscolari si verifica l’opposto: la mitofagia diminuisce all’aumentare della percentuale di mutazione. Questi dati ci spiegano perchè nei cibridi con background muscolare viene favorito il DNA mitocondriale mutato, e mostrano come possibile causa di questo comportamento la presenza di una mitofagia alterata e meno efficiente rispetto a quella dei cibridi con background polmonare.
29-gen-2014
Italiano
segregazione, mitofagia, autofagia, mtDNA, mitocondri
VERGANI, LODOVICA
BARITUSSIO, ALDO
Università degli studi di Padova
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14242/174623
Il codice NBN di questa tesi è URN:NBN:IT:UNIPD-174623