Dynamics of Epstein-Barr Virus (EBV) in human immunodeficiency virus (HIV)-1 infected adults and children

Il virus di Epstein-Barr (EBV) è coinvolto nello sviluppo di un ampio spettro di malattie linfoproliferative, in particolare nei soggetti immunocompromessi. Oltre all’immunodepressione, l’attivazione immunitaria cronica può indurre la stimolazione della cellula B, promuovendo l’espansione delle cellule infettate da EBV. I fattori che possono contribuire all’attivazione e all’espansione delle cellule B infettate da EBV, anche nei soggetti con infezione da HIV-1, sono per lo più sconosciuti. In Africa l’infezione primaria da EBV insorge durante la prima infanzia e i linfomi associati ad EBV sono un'importante causa di morbidità e mortalità nei bambini. Elevati livelli di EBV costituiscono un fattore di rischio per l’insorgenza dei tumori associati al virus. Ad oggi, non sono disponibili dati circa l’infezione da EBV e le patologie associate nei bambini africani con infezione da HIV-1. La mancanza di questi dati è in parte dovuta alla difficoltà di analisi di laboratorio nei Paesi in via di sviluppo. L'utilizzo di Dried Blood Spot (DBS) potrebbe rappresentare un metodo semplice per raccogliere, conservare campioni di sangue, e consentire il loro trasporto in laboratori specializzati. Gli scopi della ricerca svolta durante il corso di Dottorato sono stati i seguenti: 1) studiare la relazione tra viremia di EBV e marcatori di attivazione immunitaria nei soggetti con infezione da HIV-1. 2) studiare l’infezione da EBV nei bambini africani con infezione da HIV-1 e/o con tumori EBV-correlati. 3) sviluppare una nuova applicazione di DBS per la rilevazione della clonalità delle cellule B, per la diagnosi e il monitoraggio della patologia neoplastica. 1) Viremia di EBV e attivazione immunitaria in soggetti con infezione da HIV-1 Nello studio sono stati inclusi 156 pazienti con infezione da HIV-1. 85 pazienti erano in terapia antiretrovirale (ART). Il DNA di EBV è stato rilevato in 114 pazienti, e in tutti i casi tranne 3 era EBV tipo 1. I livelli mediani di EBV-DNA erano di 43[1-151] copie/105 cellule. I livelli di EBV erano più elevati nei soggetti con plasmaviremia di HIV-1 rilevabile, nonostante un buono stato immunologico (CD4>500 cellule/µl), rispetto a pazienti con plasmaviremia di HIV-1 non rilevabile, indipendentemente dallo stato immunologico (46[5-136] vs 17[1-56] copie/105 cellule, p=0.008). Pazienti con alti livelli di EBV-DNA (> valore mediano) avevano livelli più alti di lipopolisaccaride batterico (LPS) e di citochine proinfiammatorie (IL-6, IL-10 e TNF-α) rispetto a pazienti con bassa viremia di EBV. Inoltre, la percentuale di cellule B attivate correlava con i livelli di EBV (r=0.754; p<0.001). Nell'insieme, questi dati indicano una significativa associazione tra plasmaviremia di HIV-1, marcatori di attivazione immunitaria e citoviremia di EBV e suggeriscono che la persistenza di HIV-1 e l’attivazione immunitaria, indipendentemente dalla ripopolazione dei linfociti CD4 periferici, possono favorire l’espansione delle cellule B infettate con EBV. 2) Associazione tra livelli di EBV e NHL nei bambini della Tanzania e parametri relativi a EBV nei bambini con infezione da HIV-1 in Uganda E' stato condotto uno studio caso-controllo in bambini con linfomi non-Hodgkin (NHL) ammessi in tre centri clinici della Tanzania e controlli comparabili per età. I campioni di sangue sono stati raccolti in DBS. Ventuno di 35 (60%) pazienti con NHL e solo 21 di 70 (30%) controlli avevano EBV rilevabile nel sangue periferico (OR=4.77 [95% CI 1.71–13.33], p=0.003). Inoltre, i livelli di EBV erano più alti nei casi NHL rispetto ai controlli EBV-positivi (p=0.024). Nell'insieme, questi dati indicano che la viremia di EBV nel sangue periferico potrebbe avere rilevanza diagnostica. In un secondo studio, i campioni di sangue di 213 bambini con infezione da HIV-1 sono stati raccolti su DBS presso l’ospedale Nsambya, in Kampala, Uganda. Novantadue di 140 (66%) bambini in ART e 57 di 73 (78%) naive sono risultati positivi per EBV. In un'analisi multivariata per CD4 Z-score, età e stadio WHO, bambini in ART avevano minori probabilità di avere EBV rilevabile rispetto ai bambini naive (OR=0.39 [95% CI 0.16-0.94], p=0.036). La viremia di EBV era significativamente più elevata nei bambini naive rispetto a quelli in ART (4.22 [3.87-4.58] vs 3.99 [3.55-4.33] log10 copie/ml; p=0.016). I livelli di 16S rDNA, utilizzato come marcatore di traslocazione microbica, erano significativamente più elevati nei bambini naive rispetto a quelli in ART (2.16 [2.11-2.28] vs 2.09 [2.02-2.22] log10 copie/μl; p=0.007) e correlavano con i livelli di EBV-DNA (r= 0.382, p=0.016), suggerendo che i prodotti microbici circolanti promuovono l’attivazione e l’espansione della cellula B infettata da EBV. Il trattamento con ART, probabilmente limitando la viremia di HIV-1 e la conseguente attivazione immunitaria, può ridurre la replicazione di EBV e l’espansione delle cellule infettate da EBV. 3) Rilevabilità delle popolazioni clonali B da campioni di DBS: uno strumento per la diagnosi e il monitoraggio dei tumori delle cellule B In primo luogo, utilizzando campioni di sangue di diversa origine, è stato verificato che i DBS contenessero un numero sufficiente di linfociti per stimare la clonalità senza ottenere risultati falsi positivi. Mediante l'impiego di cellule Namalwa, che contengono 2 copie di EBV/cellula, è stata trovata una ottima correlazione tra i risultati attesi e le copie di EBV rilevate (r=0.987, p<0.0001); si è potuto quindi stabilire che una popolazione clonale B è rilevabile su DBS quando sono presenti almeno 200 cellule clonali nel campione analizzato. Inoltre, sono stati ottenuti risultati molto simili per la clonalità cellulare analizzando il DNA ottenuto da DBS e da sangue fresco di pazienti con leucemia linfatica cronica. Questo studio, dimostrando che è possibile valutare la clonalità su campioni di sangue conservato su DBS, allarga le opzioni diagnostiche e di monitoraggio. Conclusioni In questi studi abbiamo trovato una relazione significativa tra marcatori di traslocazione microbica, livelli di citochine pro-infiammatorie e livelli di EBV-DNA negli adulti e nei bambini con infezione da HIV-1. Di interesse e in accordo con studi precedenti, abbiamo anche dimostrato che i livelli di EBV sono più elevati nei pazienti con aumento di linfociti CD4 ma incompleta soppressione della viremia di HIV-1 rispetto a pazienti con plasmaviremia non rilevabile, indipendentemente dal numero di linfociti CD4. Nell'insieme, questi dati suggeriscono che l'attivazione immunitaria indotta da HIV-1 può risultare nella stimolazione e nell’espansione delle cellule B infettate con EBV, un fattore di rischio per lo sviluppo di neoplasie EBV-associate. La relazione tra attivazione immunitaria e livelli di EBV è risultata anche negli studi effettuati nei bambini con infezione da HIV-1, dove abbiamo trovato che i livelli di EBV-DNA e di 16S rDNA erano significativamente più elevati nei bambini in ART rispetto a quelli naive. Il trattamento con ART, probabilmente limitando l’attivazione immunitaria, potrebbe prevenire la stimolazione della cellula B e l’espansione della cellula B. Queste osservazioni possono essere di particolare interesse anche per pianificare strategie terapeutiche nei soggetti con infezione da HIV-1. Inoltre, la dimostrazione che i linfomi NHL sono significativamente associati ad elevati livelli di EBV nel sangue periferico, suggerisce che la determinazione di EBV nel sangue potrebbe avere una rilevanza diagnostica e prognostica per le neoplasie delle cellule B associate ad EBV. In questo contesto abbiamo potuto stimare che i campioni di DBS sono anche idonei ad identificare la presenza di una popolazione clonale B. Questo è importante perché estende le opzioni di diagnosi e monitoraggio dei linfomi B anche dove non sono di facile accesso queste analisi.