MicroRNAs impact in cancer: from non canonical biogenesis and functions to methodological aspects

L’informazione contenuta nel DNA appare oggi sempre più stratificata di quanto non si pensasse. In questo scenario, gli RNA non codificanti sono stati riconosciuti come RNA funzionali, portatori di informazione e parti fondamentali dei più complessi circuiti regolativi negli eucarioti. Tra i più studiati RNA non codificanti con funzioni regolative ci sono i microRNA (miRNA), RNA a singolo filamento lunghi circa 22 nucleotidi, presenti sia in piante che animali. Ci sono prove sempre più evidenti che la deregolazione dei miRNA abbia un ruolo fondamentale nei tumori solidi e del sangue. In questo lavoro abbiamo preso in considerazione le funzioni non canoniche dei miRNA, il loro coinvolgimento nei tumori, integrando analisi computazionali di dati genome-wide e dati sperimentali più specifici, con un approccio critico rispetto gli strumenti computazionali. Abbiamo innanzitutto studiato il ruolo dei miRNA nelle neoplasie mieloproliferative, più specificamente nella mielofibrosi, considerando anche altri small RNA presenti nei dati RNA-seq. Le malattie mieloproliferative sono tumori cronici della linea mieloide che vedono l’alterazione delle cellule emopoietiche CD34+, ed evolvono in leucemia acuta nei casi più gravi. In questo studio abbiamo pertanto analizzato dati di RNA-seq, prodotti con tecnologia Illumina, di cellule raccolte da pazienti affetti da mielofibrosi primaria e da controlli sani, al fine di caratterizzare i profili di microRNA e trovare gli elementi differenzialmente espressi, in quanto possibili elementi di regolazione post trascrizionale alterata e coinvolti nella genesi e nello sviluppo della mielofibrosi. Successivamente, al fine di aver piena consapevolezza dei vari passi di un’analisi computazionale, abbiamo studiato l’impatto dell’applicazione su dati di RNA corti di algoritmi di normalizzazione, sviluppati per RNA lunghi, valutato a livello dei risultati dell’analisi differenziale. Abbiamo preso in considerazione cinque tra i più comunemente usati algoritmi, per individuare la procedura che permetta di svolgere in modo più robusto l’analisi di dati RNA-seq. Abbiamo stimato i parametri della distribuzione statistica di un dataset reale di microRNA particolarmente numeroso, e abbiamo simulato un numero sostanzioso di dataset. Abbiamo generato nove tipi di data set con diverse caratteristiche controllate e abbiamo misurato l’impatto della normalizzazione nei vari casi, quantificando l’impatto sull’analisi differenziale attraverso curve ROC e AUC. Abbiamo evidenziato la necessità di nuovi algoritmi di normalizzazione, più specifici per i miRNA, in grado di colmare le grosse lacune dei metodi attuali. Ci siamo in seguito concentrati sul coinvolgimento dei microRNA nei cambiamenti dei valori di espressione genica, rilevati in cellule K562 in cui fosse silenziata la ferritina FHC. Abbiamo indagato se diversi livelli di FHC potessero modulare i livelli di espressione dei microRNA e abbiamo monitorato l’impatto dei miRNAs rispetto le modificazioni dei livelli d’espressione dei geni. A tal fine abbiamo, condotto un’analisi integrata di miRNA-mRNA in cellule K562 silenziate per la FHC (K562shFHC) confrontandole con cellule K562 trasdotte con RNA scrambled (K562shRNA). La notevole up-regolazione di quattro miRNA, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i-5p e hsa-miR-125b-5p, nelle cellule silenziate e il fatto che i loro livelli di espressione scendessero quando fosse riattivata l’espressione di FHC, supporta l’esistenza di una relazione tra FHC e la modulazione dei miRNA. Integrando le informazioni sui target dei miRNA e i profili di espressione dei geni, abbiamo identificato dei network regolativi. I nostri dati, confermati con validazioni sperimentali, indicano che il silenziamento di FHC potrebbe impattare sui livelli di RAF1/pERK1/2 attraverso la modulazione di specifici gruppi di microRNA, fornendo nuove informazioni sul rapporto tra omeostasi del ferro e miRNA. Infine, ci siamo occupati di un ruolo non canonico dei microRNA, più specificamente nel contesto delle sempre più evidenti interazioni tra RNA codificanti e RNA non codificanti. Abbiamo condotto uno studio preliminare sul coinvolgimento dei microRNA nella regolazione della traduzione alternativa e di conseguenza dell’equilibrio delle varie isoforme proteiche. C’è una maggior consapevolezza della diffusione del meccanismo della traduzione alternativa nei mammiferi. Si realizzano pattern complessi di regolazione delle isoforme grazie alla presenza, nello stesso mRNA, di più Open Reading Frame (ORF) e Translation Initiation Sites (TISs) utilizzati. Questi sono in grado di influenzarsi a vicenda in maniera diversa. E’ stato recentemente dimostrato che i miRNA sono coinvolti nella modulazione dell’equilibrio delle isoforme proteiche, legandosi ai TIS. Noi abbiamo individuato la corrispondenza di siti TIS attivi nei trascritti di mRNA, trovati sperimentalmente con GTI-seq, e siti di legame di miRNA nelle sequenze di mRNA, determinati sperimentalmente con tecnica CLASH. Questi geni in cui sono stati riconosciuti siti di legame, si suppongono coinvolti in un meccanismo di traduzione alternativa modulata da miRNAs. Alcune interazioni miRNA-tis sono state confermate sperimentalmente, ma ulteriori studi sono necessari per valutare se il meccanismo di modulazione della traduzione alternativa da parte dei miRNA possa impattare su processi cellulari e nella malattia.