Tailored PVA/ECM scaffolds for focal articular cartilage defects

I difetti condrali focali compromettono significativamente la qualità della vita dei pazienti predisponendo all'osteoartrite. Eziologicamente sussiste una forte associazione tra l'età del paziente e l’incidenza di osteoartrite, consentendo di identificarla come una malattia legata all’invecchiamento. L’osteoartrite tuttavia può essere anche conseguenza di patologie concomitanti; tra queste l’emofilia, coagulopatia ereditaria. I problemi articolari nei pazienti emofilici esordiscono già nell’infanzia, quando danni minori possono esitare in emartri ricorrenti predisponendo all’artropatia emofilica. L’assenza di trattamenti soddisfacenti per efficacia ha spinto la ricerca nell’ambito dell’ingegneria tissutale, il cui approccio di base si fonda sull’interazione tra cellule, scaffolds e fattori di crescita. L’obiettivo è di creare in vitro costrutti biologici funzionali, capaci di mimare il tessuto d’interesse dopo impianto. Alcune strategie di ingegneria tissutale sono già adottate in chirurgia ortopedica. Esse prevedono l’impianto di condrociti autologhi come tali o supportati da matrici al fine di promuovere la rigenerazione e quindi l’integrità del tessuto compromesso. Di esse tuttavia i pazienti emofilici non possono beneficiare, disponendo ad oggi di approcci volti a rallentare solamente la progressione del danno senza favorirne il recupero. Lo scopo di questo lavoro di Tesi è stato duplice. Dapprima è stato realizzato e caratterizzato un nuovo scaffold funzionale al recupero del danno cartilagineo focale. Successivamente, è stata valutata la possibilità di utilizzare i condrociti del paziente emofilico nella prospettiva di un impianto autologo. Mediante una reazione chimica di ossidazione, l’1% o il 2% dei gruppi ossidrilici presenti sul backbone del polimero sintetico polyvinyl alcohol (PVA) sono stati ossidati a gruppi carbonilici. L’avvenuta ossidazione è stata verificata mediante saggio con 2,4-dinitrofenilidrazina e binding covalente di lisozima. A seguito di cross-linking fisico delle soluzioni polimeriche, scaffolds in PVA ossidato all’1% ed al 2% sono stati quindi valutati e confrontati con scaffolds in PVA non ossidato. La microscopia elettronica a scansione ha rivelato come l’impiego di soluzioni polimeriche ossidate influenzi la continuità superficiale degli idrogeli risultanti. Inoltre, aumentando il contenuto in carbonili, anche le proprietà fisiche e di biodegradazione risultano modulate. In particolare, la meccanicità degli scaffolds, il raggio idrodinamico delle particelle, le proprietà termiche ed il grado di cristallinità degli idrogeli di PVA diminuiscono all’aumentare del grado di ossidazione. Diversamente, il rigonfiamento ed il rilascio proteico aumentano, suggerendo potenzialità di protein-delivery system. Anche le caratteristiche di biocompatibilità e biodegradazione sono state considerate. Dopo 12 settimane di impianto sottocutaneo in vivo, gli idrogeli non hanno provocato gravi reazioni infiammatorie. Tuttavia, una limitata infiltrazione linfomonocitaria da parte di cellule CD3+ e F4/80+ ha suggerito un ruolo delle popolazioni infiammatorie nel riassorbimento dell’impianto: all’aumento del grado di ossidazione è stato riscontrato un incremento del tasso di degradazione degli scaffolds. I condrociti da paziente emofilico e non emofilico sono stati quindi isolati e messi in coltura. Dopo valutazione morfologica mediante microscopia ottica, le cellule sono state comparate per l’espressione di specifici mRNA (COL2A1; COL9A3; COMP; ACAN; SOX9) attraverso RT-PCR; e per l’espressione di marker di superficie caratteristici (CD44; CD49c; CD49e; CD49f; CD151; CD26; CD73) attraverso analisi di citofluorimetria. I risultati di RT-PCR hanno confermato l’espressione dei geni target; inoltre differenze immunofenotipiche non sono state osservate tra i tipi cellulari sebbene i condrociti da paziente emofilico fossero stati esposti in vivo al sangue, tra i maggiori responsabili di citotossicità. La citofluorimetria ha mostrato dunque che entrambe le popolazioni presentavano cellule con immunofenotipo CD44+/CD49c+/CD49e+/CD151+/CD73+/CD49f-/CD26-. L’elevata espressione di molecole di adesione (e.g. CD44, CD49c, CD49e) coinvolte in interazioni cellula-cellula o cellula-matrice, ha suggerito un alto potenziale condrogenico. Essendo nota l’inadeguatezza del PVA nel promuovere l’adesione cellulare, è stato realizzato uno scaffold bio-ibrido composito combinando le proprietà meccaniche del PVA ossidato all’1% con una matrice extracellulare decellularizzata non tessuto specifica: la gelatina di Wharton. L’idrogel tal quale e la più specifica matrice da cartilagine articolare decellularizzata, combinata con il PVA ossidato all’1%, sono stati usati come controllo. Il comportamento di entrambe le popolazioni cellulari è stata valutata dopo semina sugli scaffolds. Immagini di microscopia elettronica a scansione ed il saggio di proliferazione con Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue hanno mostrato come la matrice da W’s J sostenga in modo singolare l’adesione e la proliferazione di entrambe le popolazioni cellulari. I risultati di questo lavoro di Tesi hanno consentito di identificare nel PVA ossidato un biomateriale intelligente per la realizzazione di scaffolds con proprietà meccaniche, di protein-loading, e di biodegradazione modulabili. Inoltre, questo studio ha contribuito a definire il fenotipo dei condrociti da paziente emofilico, provvedendo a fornire nuovi potenziali marker per caratterizzarli e suggerendo la possibilità di impianto autologo. Lo scaffold composito W’J/ PVA ossidato 1% potrebbe infine essere considerato come una struttura innovativa per il recupero del danno cartilagineo sia in pazienti affetti da osteoartrite idiopatica che secondaria.