Development of murine B cell platform for the isolation and characterization of mAbs against gonococcal antigens

In recent years, there has been the emergence of a number of single-B cell technologies that allow a direct sampling of the immune repertoire: these platforms retain the natural heavy and light chain pairing and avoid the inefficient hybridoma fusion step, enabling efficient mining of B cell population and allowing the discovery of rare antibodies. The aim of this project was to develop an efficient mouse B-cell cloning and expression platform allowing the generation of large libraries of diverse mAbs sampling the B cell repertoire of antigen specific antibodies after immunisation with gonococcal Outer Membrane Vesicles (OMVs). A protocol for the isolation and characterization of mAbs derived from mouse Ag-specific single Memory B-cells (MBCs) was developed, leading to the generation of a large number of antigen-specific recombinant mAbs. We analyzed 816 OMV-specific MBC-derived supernatants for their binding to the main protein components of the bacterial surface (PorB and OpaB). Most mAbs (68%) recognized the major outer membrane protein PorB; 8.7% of mAbs were against OpaB; another group cross recognized PorB and OpaB (8.9 %), while the remaining mAbs (14.4 %) recognized other unknown antigens expressed on gonococcal surface. All tested mAbs were confirmed to bind one or more gonococcal strains, demonstrating their ability to recognize the native antigens on the surface of the bacterium. Through this approach a library of functional mAbs directed against key bacterial surface proteins of gonococcus has been generated and characterized. A total of 2 recombinant anti-OpaB mAbs, 2 anti-PorB and 2 mAbs with unknown target were fully characterized for their specificity against the antigen target through Luminex assay, Western Blot and Microarray, and for their functionality, with Serum Bactericidal Assay (SBA). This method could be easily exploited for the generation of large libraries of antibodies against diverse proteins of any pathogen.

Negli ultimi anni sono emerse diverse tecnologie per l’analisi a singola cellula B che consentono un campionamento diretto del repertorio immunitario: queste piattaforme conservano il naturale appaiamento delle catene pesanti e leggere ed evitano l'inefficiente fase di fusione dell'ibridoma, consentendo un'efficiente estrazione della popolazione di cellule B e la scoperta di anticorpi rari. Lo scopo di questo progetto è stato quello di sviluppare un'efficiente piattaforma di clonaggio ed espressione di cellule B di topo che permettesse la generazione di ampie librerie di anticorpi monoclonali (mAb) diversi, per permettere il campionamento del repertorio delle cellule B alla ricerca di anticorpi specifici per l'antigene (Ag) dopo l'immunizzazione con vescicole della membrana esterna (OMV) di gonococco. È stato sviluppato un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di mAb derivati da singole cellule B della memoria (MBC) di topo specifiche per Ag, che ha portato alla generazione di un gran numero di mAb ricombinanti specifici per l'antigene. Abbiamo analizzato 816 supernatanti derivati da MBC OMV-specifici per verificarne il legame con i principali componenti proteici della superficie batterica (PorB e OpaB). La maggior parte dei mAb (68%) ha riconosciuto la principale proteina della membrana esterna PorB; l'8,7% dei mAb è risultato specifico per OpaB; un altro gruppo è risultato cross-reattivo per PorB e OpaB (8,9%), mentre i restanti mAb (14,4%) hanno riconosciuto altri antigeni sconosciuti espressi sulla superficie gonococcica. Tutti i mAb testati hanno confermato di legare uno o più ceppi di gonococco, dimostrando la loro capacità di riconoscere gli antigeni nativi sulla superficie del batterio. Con questo approccio è stata generata e caratterizzata una libreria di mAb funzionali diretti contro le principali proteine di superficie di gonococco. Un totale di 2 mAbs ricombinanti anti-OpaB, 2 anti-PorB e 2 mAbs con specificità sconosciuta sono stati approfonditamente caratterizzati per la loro specificità contro l'antigene bersaglio attraverso il saggio Luminex, il Western Blot e il Microarray, e per la loro funzionalità, con il saggio di battericidia sierica (SBA). Questo metodo potrebbe essere facilmente sfruttato per la generazione di grandi librerie di anticorpi contro diverse proteine di qualsiasi patogeno.