Effects of different CK2 inhbition strategies in tumor cells

La proteinchinasi CK2, costituita da due subunità catalitiche (a e/o a ') e due subunità regolatorie (b), è un enzima altamente conservato, che fosforila un gran numero di substrati ed è coinvolto in diverse vie di segnale e funzioni cellulari. CK2 svolge un importante ruolo anti-apoptotico, è coinvolta nel fenomeno della farmacoresistenza all’apoptosi, ed è altamente espressa in un'ampia varietà di tumori, dove opera come un "promotore cancerogeno" creando un ambiente cellulare favorevole alla sviluppo, alla crescita, e alla propagazione della malignità. Poiché la sua sovraespressione non è direttamente connessa ad uno specifico tipo di tumore, colpire CK2 può diventare un’ interessante strategia di successo data la sua generale applicabilità e suoi diffusi effetti. È importante sottolineare che le cellule tumorali sono più sensibili all'inibizione di CK2 rispetto a quelle normali, probabilmente perché sono più dipendenti da CK2 per la loro sopravvivenza, e questo va in accordo con il recente concetto di “cancer addiction” a CK2 (Ruzzene e Pinna, 2010). Pertanto, CK2 rappresenta un obiettivo adatto per lo sviluppo di farmaci antitumorali. Finora sono stati sviluppati diversi inibitori di CK2, utili non solo per indagare il suo ruolo fisiologico, ma sfruttati anche come possibili strumenti terapeutici. La maggior parte di questi composti agisce bloccando il sito di legame per l’ATP dell’enzima; alcuni di questi hanno dimostrato elevato potere inibitorio e specificità verso la chinasi, e si sono rivelati più efficaci nell’indurre apoptosi in cellule tumorali rispetto a quelle normali. La ricerca presentata in questa tesi fornisce esempi di diverse strategie di inibizione mirate a bloccare CK2, al fine di ridurre selettivamente la sua attività nelle cellule tumorali e di produrre effetti cellulari che possono contrastare la trasformazione maligna. In particolare, abbiamo utilizzato: 1) CX-4945 e CX-5011, inibitori di CK2 ATP- competitivi (Pierre et al., 2011); 2) K137-E4, un inibitore bifunzionale progettato per competere simultaneamente con ATP e con il sito di legame per il peptide substrato di CK2; 3) CRIBI-300, un composto derivato da CIGB-300, progettato per impedire la fosforilazione di substrati specifici da parte di CK2 (Perea et al., 2004). Questi tre argomenti di ricerca sono riassunti di seguito. Viene presentato anche un quarto studio che ha riguardato un composto, TBID, sviluppato partendo da un inibitore di CK2, modificandolo per renderlo selettivo nei confronti di un'altra proteinchinasi, HIPK2. Effetti degli inibitori di CK2 ATP-competitivi CX-4945 e CX-5011 in cellule resistenti all’apoptosi Gli inibitori CX-4945 e CX-5011 (sviluppati dalla Cylene Pharmaceuticals) agiscono competendo con l’ATP per il legame nella tasca catalitica di CK2. Questi composti sono molto potenti e selettivi nell’inibire CK2 (Pierre et al., 2011; Battistutta et al., 2012), il CX-4945 in particolare ha mostrato buone proprietà farmacologiche ed è in sperimentazione clinica nell’uomo con promettenti risultati. Tuttavia, i composti CX non sono mai stati utilizzati in cellule resistenti all’apoptosi. In questo lavoro dimostriamo come CX-4945 e CX-5011 siano efficaci nel ridurre l’attività endogena di CK2 e nell’indurre apoptosi in diverse linee cellulari tumorali sensibili e resistenti all’apoptosi. Abbiamo inoltre trovato che le cellule resistenti che esprimono una pompa di estrusione dei farmaci, la P-gp, vengono rese sensibili a farmaci antitumorali convenzionali grazie all’uso di CX-4945. Infatti abbiamo trovato che l’accumulo di doxorubicina viene incrementato in cellule resistenti e che il trattamento combinato con CX-4945 e vinblastina produce effetti sinergici sulla morte cellulare. Pertanto, i nostri dati suggeriscono che gli inibitori CX possono essere considerati come una valida strategia terapeutica anche nei casi di resistenza farmacologica. Effetti di inibitori di CK2 bifunzionali in cellule tumorali Una nuova strategia per inibire CK2 è basata su composti definiti come inibitori bifunzionali o bisubstrato, disegnati per legarsi contemporaneamente ai siti di legame per l’ATP e per il substrato di CK2, con lo scopo di aumentarne la selettività per CK2. Tra questi composti il K137-E4 è stato recentemente sviluppato e caratterizzato in vitro nel nostro laboratorio: è stato dimostrato che è molto potente nell’inibire la CK2 ricombinante (IC50 = 0,025 uM) e che ha buona selettività. Nello studio presentato in questa tesi, ci siamo proposti di analizzare la possibilità di utilizzo di questo composto anche in cellule. Innanzitutto abbiamo dimostrato che il K137-E4 è in grado di inibire l’attività di CK2 nativa nei confronti di substrati cellulari. Tuttavia, questo si riferisce ad esperimenti in vitro, mentre quando abbiamo trattato le cellule con il K137-E4 non abbiamo osservato alcun effetto né sull’attività di CK2 né sulla vitalità cellulare. Abbiamo pertanto ipotizzato che il composto, essendo piuttosto idrofilico, non fosse in grado di attraversare la membrana cellulare. Sono tuttora in corso modifiche strutturali della molecola mirate ad aumentarne la permeabilità cellulare senza diminuirne significativamente la sua capacità inibitoria. Ad oggi, abbiamo pensato che il K137-E4, in virtù della sua impossibilità di attraversare la membrana plasmatica, può essere utile per studiare l’attività ectochinasica di CK2, cioè di quella porzione di enzima che risiede sulla superficie esterna delle cellule (Kubler et al., 1989). Abbiamo infatti dimostrato che questo composto è capace di inibire CK2 ectochinasica, ma che ciò non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare né di cellule tumorali né di cellule non tumorali. Questa scoperta, assieme all’osservazione che l’attività ectochinasica di CK2 sembra essere simile in cellule tumorali e non, suggerisce che la CK2 ectochinasica non è implicata nella sopravvivenza cellulare e negli eventi correlati alla tumorigenesi. Effetti in vitro e in cellule di peptidi mirati a legare substrati di CK2 Un nuovo approccio recentemente introdotto per colpire CK2 è basato sullo sviluppo di un peptide ciclico, chiamato CIGB-300, che interferisce con la fosforilazione di specifici substrati di CK2 piuttosto che inibire con l’enzima per se (Perea et al., 2004). CIGB-300 è già impiegato in studi clinici (Perea et al., 2011), tuttavia il suo meccanismo d’azione è solo parzialmente conosciuto. Abbiamo dunque sfruttato un nuovo peptide sintetico, chiamato CRIBI-300, con lo stesso dominio funzionale del CIGB-300, e abbiamo effettuato studi in vitro ed in cellule, comparandolo con il CIGB-300 e altri suoi derivati. Abbiamo scoperto che l’attività di CK2 in vitro può essere influenzata dal peptide CRIBI-300, ma con effetti differenti a seconda del tipo di substrato utilizzato: abbiamo osservato inibizione solo per quei substrati la cui fosforilazione da parte di CK2 è strettamente dipendente dalla presenza della subunità regolatoria b, mentre troviamo stimolazione da parte del CRIBI-300 nei confronti di substrati che sono fosforilati preferenzialmente dalla subunità catalitica a. Questi dati suggeriscono che il CRIBI-300 potrebbe interferire con la struttura dell’oloenzima CK2, dando luogo ad una conformazione tetramerica instabile e non funzionale e impedendo la fosforilazione di substrati b-dipendenti. Anche in esperimenti di trattamento cellulare, abbiamo trovato che CRIBI-300 induce una forte riduzione dell’attività cellulare di CK2, che è però accompagnata da una precoce e rapida perdita della quantità proteica di CK2. In parallelo, CRIBI-300 induce anche morte cellulare, ma non per apoptosi. Inoltre, abbiamo osservato diminuzione delle quantità di altre proteine, oltre a CK2, e un’alterazione dell’attività dei sistemi proteolitici con l’attivazione di proteasi lisosomiali e il blocco del proteasoma. Tutti questi effetti appaiono più evidenti in cellule tumorali che in cellule non tumorali. Abbiamo poi analizzato gli effetti di derivati peptidici del CRIBI-300, con sostituzioni di singoli aminoacidi o con sequenze diverse. E’ interessante il fatto che abbiamo trovato che la sequenza Tat (la porzione del CRIBI-300 introdotta per renderlo permeabile alla cellula (Holm et al., 2006)) è essenziale per la sua attività su CK2 in vitro e in cellula, ma non è sufficiente di per se dal momento che specifici amminoacidi nella parte funzionale del CRIBI-300 (la sequenza non corrispondente a Tat) risulta essere cruciale per produrre gli effetti. Dei molti effetti causati dal CRIBI-300, abbiamo cercato di capire quali fossero mediati dalla sua azione su CK2. Abbiamo trovato che la riduzione dell’espressione di CK2 (ottenuta mediante esperimenti di “RNA interference”) attenua alcuni degli effetti del CRIBI-300, sebbene non tutti. Inoltre, quelle modifiche della sequenza del CRIBI-300 che impediscono i suoi effetti in vitro su CK2 sono anche capaci di ridurne gli effetti a livello cellulare. Possiamo perciò concludere che CK2 è sicuramente uno dei più importanti bersagli di CRIBI-300. Tuttavia altri meccanismi d’azione di questo composto devono esistere per spiegarne tutti gli effetti osservati, e ciò suggerisce quindi che un’estrema cautela è richiesta per l’utilizzo di questo composto. Effetti dell’inibitore TBID sull’attivita’ cellulare di HIPK2 Uno studio collaterale presentato in questa tesi riguarda il composto TBID, che deriva da un inibitore di CK2, il TBI, ma che è stato modificato nella struttura per renderlo selettivo nei confronti di un’altra chinasi, HIPK2 (Homeodomain-interacting protein kinase 2), una Ser/Thr chinasi che controlla la proliferazione e sopravvivenza cellulare (D’Orazi et al., 2012) il cui studio è stato rallentato dalla mancanza di inibitori specifici capaci di svelarne le funzioni cellulari. TBID è un inibitore ATP-competitivo molto potente nei confronti di HIPK2 in vitro (IC50 = 0,33 uM) e molto selettivo. In questa tesi mostriamo che TBID è anche in grado di entrare nelle cellule, dimostrando che inibisce l’attività di HIPK2 intracellulare e riduce la fosforilazione della Ser46 di p53, un sito fosforilato da HIPK2. Dal momento che TBID non è citotossico nelle condizioni utilizzate per analizzarne gli effetti sull’attività di HIPK2 cellulare, proponiamo TBID come l’unico strumento attualmente disponibile per inibire HIPK2 in cellule. I risultati presentati in questa tesi dimostrano che l’inibizione di chinasi rappresenta uno strumento estremamente versatile per l’utilizzo nelle cellule, sia per analizzare il ruolo di una specifica chinasi, sia per bloccarne una non desiderata iperattività. In particolare, nel caso di inibitori di CK2 abbiamo analizzato diverse strategie. Sebbene al momento la più efficace e convincente rimanga quella rappresentata dai classici composti ATP-competitivi, abbiamo presentato altri approcci che, pur necessitando di ulteriori studi, potranno in futuro dimostrarsi promettenti in termini di aumentata specificità o di maggiore selettività degli effetti prodotti.