Heat Shock Protein 70 e Rodlet Cells come possibili indicatori di stress in specie ittiche comunemente allevate

Scopo di questo progetto di lavoro è stato valutare la possibilità di utilizzare le “heat shock protein” 70 (Hsp70) e le “rodlet cells” (RCs) come parametri idonei alla valutazione dello stato di stress nei pesci, in particolar modo in alcune specie ittiche comunemente allevate. Nella prima parte del lavoro è stata valutata l’espressione delle Hsp70 inducibili e la localizzazione della stessa proteina, sia nella forma inducibile che costitutiva, in larve e avannotti di spigola (Dicentrarchus labrax) sottoposti a stress termico. E’ stata valutata anche, in parallelo, l’espressione e localizzazione delle Hsp70 in individui di spigola triploidi (coetanei) allevati nelle stesse condizioni e sottoposti allo stesso tipo di shock termico. I risultati ottenuti tramite RT-PCR confermano, sia per i diploidi che per i triploidi, l’avvenuta espressione della forma inducibile dell’Hsp70 in conseguenza dello stress termico. La localizzazione immunoistochimica delle Hsc70 (costitutive) conferma, sia nei diploidi che nei triploidi, la presenza pressoché ubiquitaria della proteina già a partire dai primi stadi di sviluppo e senza alcuna apparente dipendenza dall’esposizione allo stress termico. I tessuti maggiormente interessati dalla presenza della proteina sono, in genere, quelli di natura epiteliale: cute, mucosa del faringe e del tubo digerente. Stranamente non è stata osservata alcuna positività alla forma inducibile delle Hsp70, nonostante i risultati della RT-PCR confermino la presenza del messaggero. E’ stata, inoltre, analizzata l’espressione della forma inducibile delle Hsp70 in larve, giovanili e adulti di spigola sottoposti a stress da trasporto e parallelamente è stata localizzata la proteina Hsp70 nelle sue due forme, inducibile e costitutiva, negli stessi animali. L’espressione delle Hsp70, analizzato tramite RT-PCR, non rileva differenze qualitative nella produzione del messaggero tra gruppi di controllo e stressati in larve ed avannotti, differenze che, a livello qualitativo, risultano invece apprezzabili negli adulti. L’analisi quantitativa (Real-Time PCR), però, ha permesso di rilevare differenze tra controlli e stressati significative per i giovanili di 80 dph ed appena evidenti per le larve di 40 dph. Mentre, negli adulti, l’espressione del messaggero per le Hsp70 è generalmente più elevata negli stressati che nei controlli. Immunoreattività alle Hsc70 (costitutiva) è stata riscontrata in diversi tessuti appartenenti ad animali in diversi stadi di sviluppo, senza differenze di rilievo tra gli animali sottoposti a stress da trasporto e quelli del gruppo di controllo. Immunoreattività alla forma inducibile delle Hsp70 non è stata riscontrata in alcun tessuto di spigola negli stadi più precoci di sviluppo. Un esperimento analogo sullo stress da trasporto è stato effettuato successivamente utilizzando adulti di carpa (Cyprinus carpio) e trota iridea (Oncorhynchus mykiss). In questo caso è stata studiata solo la localizzazione della proteina e non l’espressione del messaggero. Nella carpa immunopositività all'Hsc70 (costitutiva) è stata riscontrata solo a livello della muscolatura rossa, sia nei controlli che negli stressati. Negli individui stressati, invece, è stata per la prima volta localizzata la presenza di Hsp70 (inducibile) nell'epitelio dei tubuli renali, oltre che nella cute e nelle branchie. Nella trota i risultati si rivelano molto simili a quelli evidenziati nella spigola per quanto riguarda le Hsc70, infatti diversi tessuti, sia dei controlli che degli stressati, esibiscono una netta positività. Nella seconda parte del lavoro è stata valutata la possibilità di utilizzare le RCs come indicatori nei confronti di stress molto comuni nell’allevamento, quali il sovraffollamento e il confinamento. Sono state utilizzate spigole adulte sottoposte a due diverse densità di confinamento (20 Kg/m3 e 80 Kg/ m3) e per due diversi intervalli temporali (2 ore e 24 ore); al termine dell’esperimento è stato valutato il numero di RCs presenti nelle branchie alle diverse condizioni di stress. E’ stata inoltre effettuata un’analisi ultrastrutturale delle RCs al microscopio elettronico a trasmissione. Dopo 2 ore di confinamento gli individui mantenuti ad una densità di 80 Kg/m3 hanno evidenziato un aumento significativo nel numero di RCs, presenti nelle branchie, rispetto agli individui confinati ad una densità inferiore (20 Kg/m3). Dopo 24 ore il numero di RCs è aumentato ulteriormente, per entrambe le densità, ma in misura significativamente maggiore negli individui mantenuti ad una densità più elevata. In conclusione, il significativo aumento nel numero di RCs osservato nelle branchie di D. labrax già dopo due ore di stress da sovraffollamento, indica che queste cellule sono influenzate dalla densità di allevamento. Inoltre, l’organizzazione in “cluster” a livello di lamelle primarie e secondarie, supporta l’ipotesi che attribuisce alle RCs un ruolo di difesa nei confronti di eventi stressanti. Le RCs in definitiva possono a pieno titolo essere considerate dei validi indicatori nello studio di alcune forme di stress nei pesci.