Structural studies of the ribosome: rRNA building blocks characterization and interactions analysis

Le prime strutture cristallizate ad alta risoluzione diedero inizio ad una nuova era negli studi sui ribosomi, era nella quale la ricerca beneficia delle coordinate spaziali di ogni singolo atomo. Gli studi che ho condotto sulla struttura tridimensionale del ribosoma puntano a compredere l’organizzazione modulare della molecola, ed allo stesso tempo ad investigare i meccanismi di interazione proteine-RNA. Tutti i risultati presentati in questa tesi riferiscono alla subunità principale 50S di Haloarcula marismortui, omettendo il filamento di RNA 5S. Motivi tridimensionali ricorrenti sono i mattoni basilari dell’architettura dello RNA ribosomiale: essi sono caratterizzati da una struttura 3D conservata, e ricorrono frequentemente all’interno della molecola. Un nuovo metodo per ricercare queste sotto strutture, basato su shape histogram, è presentato al Capitolo 2. Lo shape histogram è una rappresentazione vettoriale della distribuzione delle distanze di un insieme di punti da uno fissato. Gli shape histogram non sono solo strumenti efficienti per confrontare frammenti diversi di RNA, sono inoltre in grado di catturare le similarità strutturali nascoste dalla struttura flessibile ed altamente variabile dello RNA ribosomiale. Il metodo infatti si dimostra più efficiente di quelli noti in letteratura, ed ugualmente efficace in termini di correttezza dei risultati. Tra i loop studiati, le giunzioni di tre o più eliche sono il tipo più variabile e complesso, ed il meno caratterizzato. Gli shape histogram insieme alle sequenze di angoli formati dai frammenti congiungenti più eliche sono in grado di dare molte informazioni sulla conformazione tridimensionale di queste giunzioni: gli angoli forniscono indicazioni sull’eccentricità di una giunzione, mentre range e distribuzione dei valori degli shape histogram rivelano il folding. Basandosi su queste caratteristiche, propongo una classificazione per questi motivi rispetto alla loro conformazione nello spazio. Infine il Capitolo 4 esamina le interazioni proteine-RNA all’interno del ribosoma. Osservazioni di tipo statistico rivelano caratteristiche distintive del ribosoma rispetto alle interazioni proteiche con altri tipi di RNA, come ad esempio il ruolo dominante del gruppo ribosio. Inoltre vengono studiati i meccanismi di interazione delle proteine con i motivi strutturali, in particolare standard tetraloop, kink-turn e basi esposte. Un pattern comune di interazioni è rintracciato per le superfici di contatto formate dalle proteine con i tetraloop, caratterizzato da zone dense di interazioni fatte da aminoacidi a carica positiva (principalmente arginine). Le proteine ribosomiali rivelano inoltre un sito di contatto caratteristico nelle interazioni con i kink-turn, in corrispondenza della base esposta. Per la sua forma questo sito è stato chiamato tripod, ovvero tripode. I tripodi si sono dimostrati essere in realtà comuni a molti nucleotidi non accoppiati la cui base è esposta. Oltre ad una conformazione tridimensionale conservata, i tripodi dimostrano una preferenza verso le purine, soprattutto adenina, e tipicamente formano legami idrogeno.