Development of new antibody-drug conjugates based on Fc binding moieties for therapeutic and diagnostic applications

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono largamente utilizzati in diversi campi terapeutici e in particolare nel contro il cancro, come entità terapeutica e/o agenti direzionanti. Quest'ultima applicazione rientra nell’insieme delle diverse strategie per promuovere il trasporto selettivo dei farmaci al sito d’azione, al fine di risparmiare i tessuti sani dalla tossicità aspecifiche propria di molte terapie invasive, quali la chemioterapia, e per migliorare i risultati clinici finali. Tra le terapie direzionate rientra l'uso degli anticorpi coniugati a farmaci, che sfruttano l'azione sinergica di potenti agenti citotossici coniugati ad un anticorpo monoclonale attraverso specifici linker. L'anticorpo agisce come agente di trasporto e agente direzionante, e anche come farmaco di per sé, al fine di colpire selettivamente le cellule cancerose. Come singoli agenti terapeutici, sia gli anticorpi monoclonali che i farmaci altamente citotossici presentano problemi critici nel loro impiego clinico. Gli anticorpi monoclonali di solito devono essere usati in terapia combinata con altri farmaci perché la maggior parte di essi mostra una risposta clinica insufficiente, sebbene specifica. D'altra parte, i farmaci chemioterapici, specialmente quelli molto potenti, hanno una ristretta finestra terapeutica e, pertanto, le dosi terapeutiche sono prossime alla dose massima tollerata. A causa della mancanza di selettività per le cellule tumorali, questi farmaci presentano pesanti effetti collaterali. La brillante idea di unire anticorpi monoclonali e farmaci citotossici in un'entità unica offre la possibilità di superare i limiti appena discussi. Tradizionalmente, i farmaci sono stati coniugati in modo aspecifico ai residui di lisina o cisteina; tuttavia, l'eterogeneità del prodotto finale ha un impatto rilevante sull'attività, sulla caratterizzazione e sulla produzione dei coniugati farmaco-anticorpo, influenzando così l'efficacia della terapia. In un'epoca in cui l'omogeneità del prodotto e la riproducibilità da lotto a lotto sono prerequisiti essenziali per lo sviluppo di una nuova forma farmaceutica, lo studio di nuove tecnologie per la coniugazione sito-specifica è diventato un obiettivo primario. Nuove metodologie per la coniugazione site-specifica sono ora ampiamente studiate e alcuni esempi sono: l'introduzione di residui di cisteina mediante mutagenesi sito-diretta, l'uso di enzimi, l'inserimento di aminoacidi non naturali e la coniugazione ai glicani della regione Fc. Tuttavia, tali approcci richiedono uno sviluppo mirato e a sé stante per ogni nuovo coniugato farmaco-anticorpo, offrendo quindi poche opportunità di adattamento delle metodologie tra diversi progetti, che hanno come elementi limitanti la stabilità del linker e l'attività del farmaco. In questo lavoro, è stato proposto un nuovo costrutto per la somministrazione di farmaci attivi basato su anticorpi monoclonali che interagiscono in modo non covalente con una molecola avente alta affinità per la regione Fc (detta FcBM) e che lega anche i farmaci. L'obiettivo è il raggiungimento di un grado più elevato di omogeneità e la creazione di un sistema di somministrazione di farmaci versatile e adattabile. Il farmaco non è legato direttamente all'FcBM ma è presente un linker costituito da una catena di PEG lineare. I sistemi anti-PEG-FcBM/anticorpo, da qui chiamati sistemi farmaco-anticorpo (ADS), presentano alcuni vantaggi rispetto i coniugati farmaco-anticorpo: costituiscono una piattaforma versatile con la quale si possono utilizzare diversi anticorpi semplicemente per aggiunta al modulo farmaco-FcBM in base al tumore bersaglio/malattia da trattare. L’FcBM è il cuore del sistema e deve presentare proprietà di legame uniche per la regione Fc degli anticorpi. In questo lavoro, la proteina G (22,8 kDa), un recettore batterico per l’Fc e un Fab' caprino (≈ 50 kDa) contro l’Fc umano sono stati testati come potenziali candidati per il ruolo di FcBM, mentre una catena PEG è stata selezionata come linker per l'attacco del farmaco/marcatore. La proteina G è stata selettivamente PEGhilata all'N-terminale con un PEG 20kDa, mentre il Fab' è stato mono-, bi- e tri-PEGhilato con un PEG 5 kDa dopo la riduzione dei ponti sulfidrilici nella regione di cerniera del F(ab')2 progenitore. Studi di dicroismo circolare hanno dimostrato che i coniugati hanno conservato la struttura secondaria della proteina, mentre gli esperimenti di calorimetria isotermica di titolazione hanno determinato che la loro affinità per l’Fc è circa 107-108 M-1. Dopo la complessazione con un anticorpo modello (Trastuzumab o Rituximab), gli ADS marcati con coloranti sono stati testati in vitro mediante analisi citometrica, che mostra un'elevata selettività per le cellule che esprimono l'antigene. Inoltre, il legame dell’FcBM a un marcatore anziché ad un farmaco consentirebbe il passaggio dal campo terapeutico al campo diagnostico. La Tubulisina A (TubA), un potente inibitore della polimerizzazione della tubulina, è stato selezionato come farmaco modello e coniugato all’estremità libera del PEG attraverso un legame disolfuro. Il sistema TubA-PEG-Protein G/Trastuzumab ha mostrato un'attività citotossica preferenziale contro la linea cellulare HER2 + (SKBR-3), dimostrando così la possibile applicazione sia per scopi diagnostici che terapeutici nel cancro. Uno studio preliminare di biodistribuzione è stato condotto su topi NSG immunodeficienti, inoculati mediante iniezione sottocutanea con cellule tumorali IGROV-1 (HER2-) e SKOV-3 (HER2 +). La scansione total body ha mostrato un accumulo molto rapido di Cy5-PEG-Protein G/Trastuzumab entro 8 ore dall'iniezione. Infine, l’internalizzazione e il traffico intracellulare di un ADS, composto da un anticorpo murino IgG2a contro l'ICAM-1 umano e la proteina G come FcBM, sono stati valutati in cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC). Le HUVEC sono state stimolate con il TNFα per promuovere l'espressione del recettore ICAM-1 verso il quale l'ADS è direzionato. La microscopia di fluorescenza è stata utilizzata per seguire l'internalizzazione dell’ADS nelle cellule endoteliali. I risultati hanno rivelato che il meccanismo di internalizzazione è l'endocitosi mediata da CAM, che si basa sul legame tra il recettore e l'anticorpo anti-ICAM-1. Dopo l'internalizzazione, l'ADS segue il classico percorso verso i lisosomi per essere degradato. Ciò dimostra la possibilità di ottenere un direzionamento intracellulare selettivo di agenti attivi attraverso l'approccio ADS e apre la strada a nuove applicazioni per questa tecnologia.