Analysis of Hunter Syndrome by RNA-Sequencing

La Sindrome di Hunter (o Mucopolisaccaridosi di tipo II, MPS II) è una malattia metabolica ereditaria rara, causata da un’attività estremamente ridotta o del tutto assente dell’enzima lisosomiale iduronato 2-solfatasi (IDS), deputato alla degradazione dei mucopolisaccaridi eparan- e dermatan-solfato. Tale deficit determina un progressivo accumulo patologico delle due macromolecole sia nei lisosomi cellulari che nella matrice extracellulare di quasi tutti i tessuti ed organi, conducendo progressivamente ad un malfunzionamento generale e, infine, alla morte. Infatti, essendo l’IDS un enzima ubiquitario, quasi tutti i distretti risultano compromessi, compreso il sistema nervoso centrale nelle forme severe della malattia. La MPS II appartiene al gruppo delle mucopolisaccaridosi (MPSs), un cluster di malattie caratterizzate proprio dall’accumulo di mucopolisaccaridi (o glicosaminoglicani, GAG. Esse rappresentano, a loro volta, un sottogruppo della più ampia classe delle malattie da accumulo lisososmiale (Lysosomal Storage Disorders, LSD), una cinquantina di patologie caratterizzate dall’accumulo endo- ed extra-cellulare di diversi tipi di macromolecole non degradate. Le LSD, a lungo trascurate dalla comunità medico-scientifica, negli ultimi anni hanno ricevuto una maggiore attenzione a causa della loro elevata incidenza complessiva, fino a 1:1500–1:7000 nati vivi, anche dipendentemente dalla popolazione analizzata. Nonostante il difetto enzimatico o comunque proteico alla base di ciascuna di queste patologie sia ormai noto, per lo più sconosciuta rimane la complessità dei pathways biochimici che risultano coinvolti o alterati nell’accumulo lisosomiale in generale, o in specifici tipi di accumulo. Gli studi condotti nell’ultima decade hanno separatamente evidenziato alterazioni a carico di proteine di segnale, dell’omeostasi del calcio endocellulare, dello stress ossidativo, dell’autofagia, del trafficking intracellulare, della biosintesi dei lipidi e del metabolismo del ferro. Nessuno studio è stato, tuttavia, condotto in modo sistematico e completo per l’analisi dell’intero quadro patologico. Ciò aiuterebbe non solo ad acquisire una visione complessiva del problema dell’accumulo lisosomiale, ma anche alla messa in luce di nuovi, potenziali target terapeutici e/o di biomarcatori utilizzabili nella diagnosi delle patologie, nella definizione della loro prognosi e progressione, nella valutazione di efficacia terapeutica dei trattamenti applicati. Inoltre, poiché le LSD condividono numerosi segni e sintomi patologici, è evidente come lo studio approfondito di alcune potrebbe risultare di grande aiuto anche per la comprensione delle altre. Per la prima volta questo progetto ha valutato con tecnologia high throughput l’intero trascrittoma di cellule LSD mediante comparazione di fibroblasti cutanei ottenuti da pazienti Hunter e da controlli sani, consentendo uno studio approfondito della patogenesi della MPS II. Lo studio, condotto mediante sequenziamento di tutto l’mRNA cellulare, è stato effettuato utilizzando la tecnologia SOLiD. I risultati hanno evidenziato alterazioni a livello di: 1) processi cellulari di base, quali il ciclo cellulare, l’apopotosi, la comunicazione intercellulare; 2) processi metabolici quali il metabolismo dei proteoglicani, la sintesi dei lipidi, degli aminoacidi e dei nucleotidi; 3) la risposta agli stimoli quali lo stress ossidativo, l’insulina, le citochine; 4) l’alterazione dei processi dello sviluppo. Dal punto di vista del trattamento, nel caso della MPS II, valutata in questo progetto di studio, la terapia maggiormente applicata negli ultimi 5-6 anni è rappresentata dalla sostituzione enzimatica (Enzyme Replacement Therapy, ERT), che consiste nella somministrazione sistemica settimanale della forma attiva dell’enzima che è deficitario nei pazienti. Il monitoraggio clinico dei pazienti in trattamento, organizzato a partire dal 2005 dalla ditta che distribuisce il farmaco (Shire HGT) ha evidenziato, tra le altre cose, una importante soggettività nell’efficacia della terapia, come atteso per un trattamento effettuato per una patologia con diverse forme di severità, causata da un elevato numero di mutazioni diverse. Tuttavia l'ERT è di norma somministrato a tutti i pazienti con il medesimo protocollo. Da qui la necessità di effettuare uno studio approfondito sia clinico che molecolare allo scopo di individuare dei potenziali candidati a biomarcatori di efficacia che consentano un follow-up adeguato dei pazienti in ERT; ciò permetterebbe la messa a punto di un protocollo terapeutico personalizzato. A partire da queste considerazioni, in questo progetto è stata effettuata una valutazione dell’ERT in vitro, in fibroblasti primari Hunter trattati con l’enzima IDS terapeutico e raccolti 24 e 144 ore dall’inizio del trattamento. Il loro profilo trascrizionale è stato studiato allo scopo di caratterizzare la risposta cellulare precoce alla somministrazione dell’enzima. Tale analisi ha consentito di evidenziare una ventina di geni candidati a marcatori di efficacia terapeutica. Alcuni di questi sono stati poi valutati, mediante Real Time PCR, in alcuni campioni ematici provenienti da una popolazione di soggetti Hunter in ERT. Infine, è stato effettuato uno studio di correlazione tra l’andamento osservato dei marcatori molecolari e l’andamento di alcuni parametri clinici, provenienti dal follow-up clinico della popolazione Hunter studiata. Tale analisi ha evidenziato una buona correlazione per 8 appaiamenti gene candidato/parametro clinico valutato; in particolare, correlazioni con almeno un gene sono state trovate per la sordità, le crisi epilettiche, l’epatomegalia, la splenomegalia e altri parametri clinici. E’ auspicabile che l’estensione di tale valutazione ai rimanenti geni candidati metta in luce altri potenziali candidati biomarcatori di efficacia terapeutica