Facio-scapulo-humeral dystrophy: clinical follow-up and role of chromosome X inactivation in female patients - SHP2: a novel therapeutic target in MuSK-myasthenia

Parte I. Distrofia Facio-scapolo-omerale: follow-up clinic e ruolo dell’inattivazione del cromosoma X nelle pazienti di sesso femminile La distrofia Facio-scapolo-omerale (FSHD) e’ una distrofia muscolare autosomica dominante caratterizzata da elevata prevaleza e variabilita’ clinica. Compromette i muscoli facciali, il cingolo pelvico e, nei casi piu’ severi, gli arti inferiori. Oltre il 95% dei pazienti presenta una contrazione delle sequenze ripetute D4Z4 sul cromosoma 4q35 che determina l’ipometilazione della regione e la sovraespressione di un fattore citotossico, DUX4. In circa il 5% dei pazienti, chiamati FSHD2, l’ipometilazione del D4Z4 e’ dovuta a mutazione di SMCHD1, un gene coinvolto nell’inattivazione del cromosoma X durante l’embriogenesi. Lo scopo dello studio e’ di valutare la progressione clinica della FSHD durante un periodo di follow-up di 5 anni, usando la Clinical Severity Score (CSS), una scala precedentemente validata dal network italiano per la FSHD. Inoltre, considerando il ruolo di SMCHD1 nel controllo epigenetico del cromosoma X e le differenze nella severita’ fenotipica tra i sessi, e’ stato analizzato il pattern di inattivazione del cromosoma X per verificare se questo possa rappresentare un modificatore genetico della malatttia. Il campione di studo era costituito da 55 pazienti FSHD (29 maschi e 26 femmine) provenienti dal Centro Neuromuscolare di Padova. Tutti i pazienti erano portatori di una frammento D4Z4 di dimensioni patologiche tra 17 e 40 kb. I pazienti valutati tramite il CSS al tempo T0 sono stati rivalutati dopo una media di 5 anni (T1). Lo score di ciascun distretto muscolare, il CSS totale e lo score MRC sono stati registrati e comparati tra T0 e T1. L’inattivazione del cromosoma X e’ stata analizzata in 38 FSHD1 e FSHD2 pazienti femmine misurando il grado di metilazione delle sequenze ripetute CAG del recettore degli androgeni. Il DNA genomico e’ stato digerito con enzimi di restrizione metilazione sensibili (HpAII and HhAI), amplificato tramite PCR e infine genotipizzato. 48 soggetti sani sono stati studiati come controlli e il pattern di inattivazione del cromosoma X e’ stato correlato con il grado di coinvolgimento muscolare misurato con il CSS. Dopo 6 anni di follow-up, la differenza media del CSS tra T0 e T1, lo score MRC del bicipite, tricipite e tibiale anteriore sono risultati significativi solo nel gruppo dei probandi. Nessuna differenza significativa e’ emersa per periodi di follow-up inferiori e nel gruppo dei familiari. La progressione di malattia e’ risultata indipendente dalla dimensione del frammento D4Z4 e non sono risultate differenze tra i sessi. Il pattern di inattivazione del cromosoma X e’ risultato normalmente distribuito sia nei pazienti sia nei controlli. Una moderata correlazione lineare e’ stata riscontrata tra la percentuale di inattivazione del cromosoma X e la severita’ del cingolo scapolare ma non negli altri distretti muscolari. In conclusion, i sintomi della FSHD appaiono progredire lentamente nel tempo e, sebbene il CSS rappresenti un valido strumenti per la caratterizzazione dei pazienti, manca di sensitivita’ nell’identificazione di sfumate modificazioni cliniche perfino in un periodo di 5 anni. Pertanto il suo uso nel follow-up appere limitato. Inoltre, il pattern di inattivazione del cromosoma X riflette la distribuzione normale osservata nelle femmine sane e correla solo modestamente con la severita’ della malattia. Questi ultimi risultati suggeriscomo che diversi regolatori genetici sono coinvolti nella completa espressione fenotipica della malattia rendendo complessa la valutazione di potenziali terapie. Parte II. SHP2: un nuovo target terapeutico nella miastenia-MuSK. La miastenia grave mediata da anticorpi anti Muscle Specific Kinase (MuSK-MG) e’ una malattia autoimmune che compromette la trasmissione neuromuscolare determinando faticabilita’ e una debolezza muscolare generalizzata. In condizioni fisiologiche, l’agrin attiva il complesso LRP4-MuSK, iniziando una cascata fosforilativa che culmina con la clusterizzazione dei recettori dell’acetilcolina (AChR). SH2 domani-containing phosphatase (SHP2) e’ un regolatore negativo della clusterizzazione degli AchRs che inibisce la fosforilazione di MuSK. Nella MuSK-MG, autoanticorpi contro MuSK, appartenenti soprattutto alla sottoclasse delle IgG4, bloccano l’interazione tra MuSK e LRP4 e, pertanto, la sua attivazione. La ridotta popolazione di IgG1-3 sembra operare in modo differente. Sebbene la MuSK-MG sia una malattia trattabile, una terapia mirata specificamente ai meccanismi patogenetici sottostanti non e’ ancora disponibile. Lo scopo dello studio e’ di confermare ed estendere i risultati preliminari che hanno dimostrato l’effetto in vitro di uno specifico inibitore di SHP2, NSC-87877, come potenziale specifico trattamento per la MuSK-MG. Le IgG totale e le relative sottoclassi (IgG1-3, IgG4) sono state purificate dal plasma di 3 pazienti MuSK-MG. Il titolo degli anticorpi anti-MuSK e’ stato misurato tramite test radioimmunologico. Per testare gli effetti di NSC-87877 sulla fosforilazione di MuSK e sulla clusterizzazione degli AchR, sono stati usati miotubi di cellule C2C12. I miotubi sono stati incubati con concentrazioni crescenti di NSC-87877 a differenti intervalli di tempo (da 15 a 360 minuti) usando rispettivamente agrin e DMEM come controlli positivo e negativo. Per verificare che il farmaco fosse in grado di contrastare gli effetti patogenici degli anticorpi anti-MuSK, i miotubi sono stati esposti ad agrin assieme alle IgG totali, IgG1-3 e IgG4 anti-MuSK e in presenza o assenza di NSC-87877. La fosforilazione tirosinica e l’espressione di MuSK sono state misurate tramite western blotting e il livello di fosforilazione espresso come ratio dei valori densitometrici tra la MuSK fosforilato e MuSK totale. Per la quantificazione della clusterizzazione degli AChRs, i miotubi sono stati colorati con α-bungataroxin-594 e le immagini acquisite e analizzate tramite il software ImageJ. Per ogni esperimento sono state acquisite almento 20 immagini con successiva conta dei cluster di dimensioni superiori > 5 μm. In assenza di agrin, NSC-87877 ha determinato un aumento dose-dipendente sia della fosforilazione di MuSK sia del numero dei cluster di AChRs, con effetto massimo alla dose di 100 μM e dopo 40 minuti di incubazione. Alla dose di 100 μM, NSC-87877 ha inoltre incrementato la fosforilazione di MuSK in presenza delle IgG totali e dell IgG4 purificate mentre nessun cambiamento significativo e’ stato osservato con le IgG1-3. Ciononostante, sia le IgG totali sia tutte le sottoclassi IgG hanno determinato la dispersione dei clusters di AChRs (vedi anche Koneczny et al, 2013) e NSC-87877 e’ risultato in grado di revertire i loro effetti patologici in tutti i campioni studiati. L’inibizione di SHP2 da parte di NSC-87877 e’ in grado di indurre la fosforilazione di MuSK e di aumentare la clusterizzazione degli AChRs indipendentemente dalla stimolazione diretta da parte di agrin. Inoltre, NSC-87877 induce l’attivazione di MuSK nonostante gli effetti inibitori degli anticorpi IgG4 anti-MuSK e aumenta la clusterizzazione degli AChRs in presenza di tutte le differenti sottoclassi di anticorpi. Pertanto, indipendentemente dal tipo di sottoclassi IgG, l’inibisione di SHP2 rappresenta una potenziale strategia terapeutica nella miastenia anti-MuSK e ulteriori studi potranno dimostrare la sua efficacia e affidabilita’ in vivo.