Novel insights into botulinum neurotoxins mechanism of action and the discovery of prophylactic inhibitors against botulism

Le neurotossine botuliniche (BoNTs) sono le esotossine più potenti attualmente conosciute nonché gli agenti eziologici di una grave malattia neuroparalitica, il botulismo. Storicamente classificate in 7 sierotipi (A-B-C-D-E-F-G), perché antigenicamente differenti, il loro numero risulta in rapida crescita poiché ogni sierotipo esiste in più sottotipi, la cui presenza sta progressivamente palesandosi grazie all’introduzione delle moderne tecniche di next generation sequencing (NGS). Sebbene il botulismo rappresenti un problema sanitario minore, la scoperta di nuovi inibitori contro le BoNTs è di assoluto rilievo dal punto di vista socio-economico visti i limitati trattamenti ad oggi disponibili e il possibile utilizzo delle tossine botuliniche come potenziali agenti di bioterrorismo. Dal punto di vista strutturale, tutti i diversi sierotipi sono costituiti da due catene polipeptidiche unite covalentemente da un unico ponte disolfuro: una catena pesante (H, 100 kDa) e una leggera (L, 50 kDa). Dal punto di vista funzionale, la stessa struttura può essere invece suddivisa in tre principali domini con un determinato ruolo nel processo di intossicazione: 1) HC, definito anche dominio di legame, media l’adsorbimento specifico della tossina alla membrana plasmatica del motoneurone, 2) HN, denominato anche dominio di traslocazione, costituisce un canale di permeazione attraverso cui 3) L, riconosciuto essere il dominio catalitico, viene traslocato nel citoplasma. Qui, la catena leggera (L) viene liberata attraverso la riduzione del legame disolfuro intercatena ed è quindi pronta ad esercitare la sua funzione enzimatica. In dettaglio, le BoNTs sono metalloproteasi zinco-dipendenti capaci di idrolizzare in maniera specifica le proteine SNARE. Ogni sierotipo presenta un preciso bersaglio molecolare: BoNT/A e /E idrolizzano un diverso legame peptidico della proteina SNAP-25, BoNT/B, /D, /F e /G proteolizzano la proteina VAMP2, mentre, BoNT/C è in grado di idrolizzare due substrati differenti, sintaxina e SNAP-25. Le proteine SNARE costituisco il cuore del macchinario biochimico che permette il riconoscimento e la fusione delle vescicole sinaptiche con la membrana presinaptica del terminale nervoso a livello della giunzione neuromuscolare, pertanto, la loro idrolisi porta al blocco del rilascio di acetilcolina, inducendo neuroparalisi di tipo flaccido, conseguenza tipica del botulismo. In una prima parte del lavoro, utilizzando un approccio farmacologico, si è dimostrato come il sistema ossido-riduttivo Tioredossina (Trx)-Tioredossina Reduttasi (TrxR) dell’ospite abbia un ruolo chiave nella riduzione citosolica del ponte disolfuro intercatena di tutti i sierotipi di BoNTs. In dettaglio, utilizzando colture neuronali primarie, si è potuto dimostrare come tali molecole siano in grado di proteggere la coltura modello dall'intossicazione. Inoltre, i dati ottenuti in vitro sono stati confermati in vivo: la somministrazione dei differenti inibitori, in un modello murino, porta ad una diminuzione della severità e della durata della paralisi flaccida nonché ad una sostanziale protezione in topi trattati con dosi letali di tossina. Infine, si è riusciti ad identificare il sistema della TrxR/Trx a livello delle vescicole sinaptiche. In particolare, si è compreso come entrambi le proteine si arricchiscano a livello delle vescicole sinaptiche docked, ossia quelle legate alla membrana presinaptica pronte a rilasciare il neurotrasmettitore in esse contenuto. Questa evidenza è di particolare importanza se si prende in considerazione un possibile ruolo di tali proteine nel processo di neuroesocitosi. In un successivo lavoro, si è dimostrato come l'endocitosi all'interno del terminale nervoso, può essere considerato un altro passaggio chiave nel meccanismo d’azione delle tossine botuliniche, da prendere in considerazione nello sviluppo di nuovi inibitori. In dettaglio, un gruppo americano nel 2014 ha dimostrato come una piccola molecola, chiamata EGA, sia capace di bloccare l’azione di diverse tossine batteriche e virus che utilizzano gli endosomi come “cavallo di Troia” per il loro ingresso nelle cellule. Sebbene il target intracellulare risulta ancora non noto, si è deciso di sintetizzare e testare tale inibitore per capire se anche nel caso delle tossine botuliniche sia in grado di inibire il loro ingresso in vitro e in vivo. I risultati ottenuti evidenziano come EGA sia capace di inibire in vitro l’azione di molteplici sierotipi di BoNTs: A e B, comunemente associati a casi di botulismo umano e utilizzati in terapia, e D, coinvolto in casi di botulismo animale. Inoltre, questa molecola risulta efficace nel prevenire la paralisi in vivo dovuta ai sierotipi B e D e ritarda quella dovuta al sierotipo A. Di conseguenza, i nostri risultati suggeriscono come questa molecola possa essere presa in considerazione come lead farmacologico per lo sviluppo di nuovi antidoti. L’identificazione di questi inibitori potrà avere importanti implicazioni applicative volte a compensare il gap attualmente presente nel campo della prevenzione/terapia del botulismo. Infatti, il grande numero di sottotipi (>70) e la potenziale (probabile) esistenza di varianti non ancora identificate, è notevolmente limitante al controllo della loro azione patogena con il solo utilizzo di strumenti immunologici, quali antisieri e vaccinazione. In questa tesi verrà discusso come il nostro approccio risulta essere, invece, indipendente dal sierotipo di BoNTs coinvolta nell'intossicazione, dunque indipendente dall'antigenicità delle diverse tossine.