Wnt pathway co-factors TCF1 and TCF4 control glioblastoma phenotype through an oxygen-dependent mechanism

Il Glioblastoma multiforme (GBM) è il più comune dei tumori cerebrali nell’adulto e rappresenta tuttora una patologia dalla prognosi molto infausta e senza trattamenti efficaci. Purtroppo i meccanismi biologici che portano alla formazione di questo tumore e che ne sostengono l’aggressività sono scarsamente caratterizzati. Finora molte evidenze scientifiche dimostrano come una piccola popolazione di cellule staminali tumori sia la responsabile dell’insorgenza e della crescita del GBM. Di conseguenza, la possibilità di riprogrammare queste cellule verso un fenotipo meno aggressivo e differenziato è stata valutata da molti ricercatori negli ultimi anni. Per capire in maniera più approfondita i meccanismi responsabili del mantenimento del fenotipo staminale di queste cellule diventa di fondamentale importanza studiare approfonditamente il microambiente circostante la massa tumore del GBM e caratterizzare gli stimoli che guidano la proliferazione e l’autorinnovamento delle cellule di GBM. Il microambiente tumore è costituito da un gradiente di ossigeno per cui le cellule tumori sfruttano bassi livelli di ossigeno, condizione denominata ipossia, per mantenere le loro caratteristiche staminali. Lo studio della nicchia ipossica in cui risiedono le cellule tumori di GBM ha portato alla dimostrazione che il fattore di trascrizione HIF-1α è responsabile del controllo di numerosi processi biologici responsabili del mantenimento del fenotipo scarsamente differenziato di queste cellule. Tra le molteplici vie di segnale regolate da HIF-1α troviamo il pathway di Wnt/β-catenin. Studiando le relazioni che intercorrono tra queste due vie di segnale, il nostro gruppo di ricerca ha caratterizzato un meccanismo biologico di differenziamento neuronale delle cellule di GBM indotto in sincronia dalle vie di segnale controllate da HIF-1α e Wnt. Questo processo risulta essere fortemente dipendente dai livelli di ossigeno presenti nel microambiente. Infatti, cellule di GBM coltivate in condizioni di ipossia vanno incontro a differenziamento neuronale dopo attivazione del pathway di Wnt. Tale processo potrebbe rappresentare uno strumento efficace per riprogrammare le cellule di GBM verso un fenotipo meno aggressivo e per questo motivo abbiamo approfondito i meccanismi che inducono tale processo nelle cellule primarie di GBM derivate da paziente. Il nostro obiettivo è stato quello di caratterizzare in maniera univoca il ruolo dei fattori trascrizionali TCF1 e TCF4, appartenenti alla via di segnale di Wnt, nel determinare il fenotipo del GBM. Abbiamo confermato che l’attivazione del pathway di Wnt induce due diversi effetti fenotipici nelle cellule di GBM a diverse concentrazioni di ossigeno. Successivamente abbiamo dimostrato che, in condizioni di ipossia, il differenziamento neuronale osservato nelle cellule di GBM è mediato da un complesso trascrizionale formato da TCF1, HIF-1α e β-catenin. Inoltre, esperimenti di ChIP-sequencing hanno confermato la capacità di questo complesso trascrizionale di regolare in maniera attiva specifiche sequenze genomiche del DNA delle cellule di GBM ed attivare la trascrizione di geni implicati in processi di differenziamento neuronale. Abbiamo confermato questi risultati silenziando TCF1 nelle cellule di GBM coltivate in condizioni di ipossia ed abbiamo dimostrato che il differenziamento neuronale, altrimenti indotto in presenza di TCF1, viene completamente bloccato dopo attivazione del pathway di Wnt. Al contrario, abbiamo riscontrato una preponderante espressione di TCF4 ad alti livelli di ossigeno (ossigeno ambientale, 20%), in cui le cellule di GBM non subiscono il differenziamento neuronale osservato in ipossia e mantengono un fenotipo prettamente staminale. Per giustificare tale fenotipo dopo attivazione del pathway di Wnt, abbiamo ipotizzato che, tra le molteplici isoforme di TCF4, quelle a carattere inibitorio sulla trascrizione potessero bloccare il processo di differenziamento neuronale, altrimenti attivato dal pathway di Wnt in ipossia, e favorire il fenotipo non differenziato delle cellule di GBM. Per dimostrare quest’ipotesi abbiamo silenziato TCF4 in cellule di GBM coltivate in normossia ed abbiamo osservato che l’attivazione del pathway di Wnt induce in maniera significativa il differenziamento neuronale osservato in ipossia. Inoltre, se le cellule di GBM sono forzate ad esprimere l’isoforma inibitoria di TCF4, TCF4E, il fenotipo acquisito dalle cellule di GBM risulta essere non differenziato, confermando la capacità di inibire tale processo in cellule di GBM coltivate ad alti livelli di ossigeno. In questo studio abbiamo dimostrato che la cooperazione tra il pathway di Wnt e HIF-1α è in grado di indurre un cambiamento nel fenotipo di cellule di GBM in condizioni di ipossia. Il processo di differenziamento neuronale osservato in queste cellule dipende esclusivamente dal microambiente e, in particolare, risulta essere specifico per cellule non differenziate di GBM coltivate in ipossia. La dimostrazione che è possibile modulare il fenotipo di queste cellule in maniera specifica e dipendente dai livelli di ossigeno rappresenta una potenziale strategia futura per ridurre l’aggressività e la resistenza ai trattamenti di queste cellule.