Protein kinase ck2 phosphorylates the neuronal chaperone hsj1: a paradigmatic example of ubiquitin signaling regulation

La proteinchinasi CK2 è una serina/treonina chinasi espressa ubiquitariamente in tutti i tessuti dove svolge un importante ruolo anti-apoptotico. Questo enzima fosoforila una molteplicità di substrati coinvolti nella proliferazione e sopravvivenza cellulari ed accomunati dalla presenza di un “sito consenso”. Questo sito presenta un residuo di serina (S) o treonina (T) inserito in un intorno di amminoacidi acidi che definiscono il motivo minimo S/TXXE/pS/pY/pT: X rappresenta un generico amminoacido mentre E/D/pX sono residui acidi o fosforilati in precedenza. Elevati livelli di espressione di CK2 sono stati riscontrati in neoplasie dove il suo ruolo anti-apoptotico promuove la proliferazione e l’invasione delle cellule cancerose. Di conseguenza, l’enzima è considerato un importante bersaglio, contro cui sono stati sviluppati negli anni diversi inibitori in grado di ridurne l’attività. Tuttavia, vi sono ormai evidenze del coinvolgimento di CK2 nello sviluppo e funzione neuronali; inoltre, è stato suggerito, ma non studiato nel dettaglio, che il ruolo di CK2 nei neuroni possa avere ripercussioni nella progressione e sviluppo di malattie neurodegenerative. Abbiamo notato che uno dei “sito consenso” riconosciti da CK2 nei suoi substrati, coincide con una sequenza all’interno di un motivo in grado di legare l’ubiquitina (UIM) della proteina HSJ1. HSJ1, espressa prevalentemente in cellule neuronali, agisce da “chaperone molecolare”: controlla l’assemblaggio (folding), disassemblaggio, aggregazione e degradazione delle proteine che riconosce mediante i suoi domini UIM, mantenendo i loro livelli in equilibrio dinamico (proteostasi). Ne consegue che HSJ1 esercita un ruolo neuroprotettore. Infatti, sono state identificate alcune mutazioni a carico del suo gene DNAJB2, ed associate all’insorgenza di alcune malattie neurodegenerative. Inoltre, alcune di queste mutazioni sono in grado di compromettere la funzione neuroprotettiva di HSJ1. Il progetto di questa tesi si pone come obiettivo di dimostrare che la fosforilazione di alcuni residui di HSJ1 da parte di CK2 è in grado di influenzarne la funzione. HSJ1 è una proteina appartenente alla famiglia detta DNAJ cui membri sono accomunati dalla presenza del dominio proteico detto “dominio J”. HSJ1, come detto prima, contiene anche due domini UIM localizzati al C-terminale. Il genoma umano codifica un unico trascritto, poi processato per produrre due isoforme: HSJ1a, espressa nel citosol, ed HSJ1b, ancorata alla faccia esterna del reticolo endoplasmatico. Entrambe le isoforme cooperano con la proteina Hsp70 nel legare e dirigere proteine ubiquitilate al proteasoma per essere degradate. In particolare, HSJ1a promuove la degradazione di proteine prone all’aggregazione. Infatti, il non corretto folding proteico può causarne la deposizione come aggregati intracellulari tossici, detti amiloidi, e considerati come un sintomo indicativo nella diagnosi di molte malattie neurodegenerative. Ad esempio, HSJ1a è tra i mediatori della degradazione della proteina SOD1 (superossido dismutasi 1) coinvolta nella sclerosi laterale amiotrofica, di proteine con tratti poliglutamminici espansi ed associati alla malattia di Huntington, ed infine della proteina ataxina-3, considerata agente eziologico nelle atassie spinocerebellari. Inoltre, HSJ1a coadiuva il folding della proteina parkina coinvolta nell’insorgenza di alcune forme del morbo di Parkinson. Studi di associazione genetica hanno anche dimostrato che alcune mutazioni nel gene DNAJB2 causano neuropatie motorie ereditarie e la malattia di Charcot Marie Tooth - tipo 2. Tuttavia i meccanismi molecolari mediante cui HSJ1 agisce sono stati compresi solo parzialmente. I risultati che abbiamo ottenuto dimostrano che HSJ1 è fosforilata da CK2. Come detto in precedenza, HSJ1 presenta alcuni residui amminoacidici all’interno del suo dominio UIM che sono potenzialmente fosforilabili da CK2. Abbiamo quindi svolto un’analisi in spettrometria di massa della proteina fosforilata che ci ha permesso di identificare i siti riconosciuti da CK2 che sono: i residui di serina alle posizione 247, 250 e 264. Successivamente, abbiamo espresso HSJ1 in cellule mediante vettori di espressioni eucariotici. Questi esperimenti erano atti a dimostrare che HSJ1 è fosforilata anche in cellule da CK2. Infatti, trattamenti in cui l’attività dell’enzima è stata ridotta mediante l’uso dell’inibitore CX-4945, hanno dimostrato che HSJ1 è substrato di CK2. Inoltre, abbiamo operato singole sostituzioni amminoacidiche a carico dei residui serinici riconosciuti dall’enzima che sono stati mutati in residui alaninici. Ciò ha confermato ulteriormente i siti da noi identificati su HSJ1 come fosforilati da CK2, sia in vitro che in cellule. Collettivamente, i dati raccolti confermano che il sito principale di fosforilazione è la serina alla posizione 250. Il residuo alla posizione 264 contribuisce solo marginalmente. La serina 247 invece è definita come un sito gerarchico. Infatti, l’intorno amminoacidico del residuo alla posizione 247 non soddisfa i requisiti minimi per essere definito “sito consenso” per CK2. Ciò può avvenire solo una volta che la serina 250 è fosforilata. Di conseguenza, la serina 247 potrà essere riconosciuta da CK2 grazie al residuo acidico in posizione +3, in questo caso rappresentato dalla serina 250 fosforilata in precedenza. Abbiamo poi ideato e sviluppato una strategia che ci ha permesso di produrre anticorpi in grado di riconoscere in maniera specifica le serine alla posizione 247 e 250, solo nel caso esse siano fosforilate da CK2. Questo strumento è stato utilizzato per confermare che entrambe le isoforme di HSJ1, a e b, sono fosforilate in cellule. Inoltre, abbiamo potuto verificare che la fosforilazione di HSJ1a è sensibile all’inibizione esercitata da un ampio pannello di inibitori specifici di CK2. Abbiamo poi analizzato se la fosforilazione di HSJ1 possa avere un impatto sulla sua funzione di legare proteine ubiquitinate da convogliare al proteasoma per la degradazione. Abbiamo quindi espresso HSJ1 in cellule, nella sua forma originale o mutata nei siti di fosforilazione. Mediante la co-precipitazione della proteina, a cui permangono legati i partner ubiquitilati, abbiamo potuto dimostrare che la fosforilazione dei siti-chiave da noi identificati causa una minor funzionalità del dominio UIM di HSJ1. Al contrario, la prevenzione della fosforilazione aumenta la capacità del dominio UIM di legare proteine ubiquitilate e di trasportarle al proteasoma, come abbiamo verificato nei riguardi della proteina luciferasi. Abbiamo potuto così concludere che la fosforilazione di HSJ1 da parte di CK2 contrasta la sua funzione di “chaperone molecolare”. Questo studio ci ha consentito di dimostrare una nuova connessione tra HSJ1 e CK2, in grado di aiutarci a comprendere meglio i meccanismi molecolari che sottendono l’insorgenza e lo sviluppo delle malattie neurodegenerative. Vi sono inoltre importanti risvolti terapeutici, dal momento che l’uso di inibitori di CK2 potrebbe essere proposto per aumentare la funzionalità di HSJ1. Infine, abbiamo notato che alcuni residui amminoacidici all’interno del motivo UIM sono evolutivamente conservati e coincidono con la “sequenza consenso” minima richiesta per la fosforilazione da parte di CK2. Pertanto consideriamo altamente probabile che altre proteine contenenti domini UIM possano essere substrati di CK2, come dimostriamo in questa tesi anche per la proteina S5a, una subunità del proteasoma. Pertanto, HSJ1 vuole porsi come esempio paradigmatico di una possibile più ampia regolazione da parte di CK2 in grado di influenzare questa via di segnale mediata dall’ubiquitina. Progetti complementari Dalla scoperta del coinvolgimento della proteinchinasi CK2 nel cancro, le cellule neoplastiche si sono rivelate essere più sensibili all’inibizione della sua attività, rispetto alle cellule sane. Questo ha favorito lo sviluppo di molti inibitori alcuni dei quali sono al momento brevettati e/o in trials clinici. Tuttavia, come suggerito dal lavoro principale di questa tesi, queste molecole si sono rivelate utili strumenti per meglio comprendere il ruolo di CK2 in altre patologie (i.e. nelle malattie neurodegenerative) e potrebbero essere presi in considerazione per il loro trattamento. Nonostante l’uso diffuso di inibitori di CK2, la comprensione del loro meccanismo d’azione e tollerabilità non sono stati ancora del tutto chiariti. Molti degli inibitori sviluppati fino ad ora sono ATP-competitivi, quindi in grado di legarsi alla tasca per i nucleotidi in CK2. Tuttavia, si stanno prendendo in considerazione strategie differenti per cercare di aumentarne l’efficacia terapeutica. In progetti complementari all’argomento principale di questa tesi, abbiamo analizzato due strategie di inibizione alternative. La prima ha riguardato lo sviluppo di una molecola chimerica chiamata CK2-MCP. Questa è in grado di legare per complementarietà il “sito consenso” di CK2 nei suoi substrati, impedendo all’enzima di accedervi per fosforilarli. Abbiamo però dimostrato che questa classe di composti è in grado di legare sia i substrati di CK2, come atteso, che l’enzima stesso. Nel secondo progetto complementare, abbiamo invece preso in considerazione un altro tipo di strategia duale, mediante l’uso di un inibitore sviluppato recentemente, detto TDB. Questo composto è in grado di inibire sia CK2 che Pim-1, un’altra proteinchinasi implicata nello sviluppo tumorale. Abbiamo comparato i composti CX-4945 e TDB per la loro capacità di inibire CK2 e di ridurre la vitalità delle cellule cancerose. Differenti tempi e condizioni di trattamento hanno dimostrato la più alta persistenza dell’inibizione di CK2 esercitata dal TDB in cellule, nonostante la superiorità del CX-4945 in vitro. La maggior durata dell’inibizione di CK2, indipendentemente dal fatto che il TDB inibisca anche Pim-1, sembra essere responsabile dei maggiori effetti citotossici indotti dal TDB nelle cellule tumorali. Questo suggerisce che l’ottimizzazione di inibitori di CK2 in cellule debba tenere conto anche di questo parametro.