Quantitative estimate of biochemical and electrical intercellular coupling in the developing cochlea of wild type and DFNB1 mouse models

La perdita dell’udito è la forma più comune di disabilità sensoriale: circa un bambino su 1000, infatti, è affetto alla nascita da sordità congenita profonda. La sordità non sindromica (DFNB1) è una malattia ereditaria con un fenotipo di sordità che va da lieve a grave, causata da mutazioni nei geni GJB2 (che codifica la proteina connessina26) e GJB6 (che codifica la connessina30). Canali giunzionali formati prevalentemente da queste due proteine accoppiano le cellule non sensoriali (cellule di sostegno e cellule epiteliali) della coclea dei mammiferi, le quali formano vasti sincizi funzionali. Studi precedenti hanno dimostrato che l’accoppiamento elettrico e metabolico mediato da canali giunzionali è fondamentale per lo sviluppo e il mantenimento dell’udito. Tuttavia, nonostante il gran numero di studi condotti in sistemi di espressione, mancano stime precise del grado di accoppiamento e delle sue alterazioni in condizioni DFNB1. In questo lavoro di tesi, sono state combinate registrazioni ottiche su larga scala , registrazioni elettrofisiologiche su singola cellula e simulazioni al computer per chiarire i meccanismi che sono alla base della comunicazione intercellulare nelle cellule cocleari non sensoriali in topi giovani (prima settimana post-natale) . In primo luogo, abbiamo sviluppato una nuova tecnica basata sull’imaging del potenziale di membrana cellulare per mappare l’estensione e il grado di accoppiamento elettrico nelle reti cellulari non sensoriali della coclea in via di sviluppo . Abbiamo anche quantificato con precisione la riduzione dell’accoppiamento elettrico in colture organotipiche cocleari da topi transgenici con difetti uditivi causati dall’assenza o da mutazioni della connessina30 rispetto ad animali wild type. Confrontando i nostri risultati sperimentali con simulazioni numeriche , abbiamo stimato che le cellule non sensoriali della coclea nel topo sono già ben accoppiate nella prima settimana post-natale da ben ∼ 1500 canali per ogni coppia di cellule. Nelle colture di pari età provenienti da topi connexin30(T5M/T5M) e connexin30(−/−), la conduttanza giunzionale è ridotta rispettivamente del 14% e del 91% , e questi dati sono in accordo con l’aumento delle soglie uditive mostrato da questi animali nella fase adulta . Oltre a fornire l’accoppiamento elettrico , é stato dimostrato che i canali giunzionali dell’orecchio interno partecipano alla segnalazione Ca2+ intracellulare dipendente dall’ATP e dall’IP3, e l’alterazione di questi meccanismi di segnalazione nella coclea postnatale é stata collegata alla compromissione dell’acquisizione dell’udito. Abbiamo quindi eseguito esperimenti di imaging dello ione Ca2+ volti a chiarire i meccanismi alla base della generazione e propagazione intercellulare dei segnali Ca2+ mediati da ATP nelle cellule non sensoriali della coclea. Abbiamo determinato che le oscillazioni Ca2+ dipendenti dall’ATP e dall’IP3 nelle cellule non sensoriali cocleari possono verificarsi in presenza di una concentrazione intracellulare di IP3 costante. Abbiamo poi combinato le informazioni raccolte attraverso i due diversi approcci sperimentali in un modello matematico che (i) riproduce correttamente la velocità e il range di propagazione delle onde Ca2+ intercellulari e (ii) indica che l’inizio e il culmine delle oscillazioni Ca2+ sono contrassegnati da biforcazioni di Hopf supercritiche a concentrazioni di ATP di ∼ 100 nM e ∼ 1 μM, rispettivamente . Infine , abbiamo studiato la relazione tra transienti Ca2+ spontanei delle cellule non sensoriali e i potenziali d’azione spontanei delle cellule ciliate interne. I nostri risultati preliminari suggeriscono che i transienti Ca2+ delle cellule non sensoriali potrebbero avere un effetto modulatorio sull’attività elettrica spontanea , che è intrinsecamente generata nelle cellule ciliate interne.