La risposta di difesa degli organismi agli insetticidi: dall’ecologia dello stress al controllo di artropodi vettori

Tra i principali argomenti di studio della biologia vi sono i meccanismi con cui le cellule e gli organismi sono in grado di mantenere l'omeostasi in un ambiente avverso, ricco di stress chimici e fisici. “L’obbligo” di sopravvivenza che guida ogni organismo quando viene esposto ad agenti tossici, come sostanze chimiche tossiche endogene o composti xenobiotici, ha portato all’evoluzione di una serie di famiglie di geni e di pathways che, nell’insieme, prendono il nome di "defensoma chimico". Questa rete di difesa integrata, che permette ad ogni organismo di avvertire, trasformare ed eliminare le sostanze chimiche tossiche, è stata recentemente sottoposta ad approfondite indagini, in particolare modo negli artropodi, in merito alla loro grande importanza economica, ambientale e medico-veterinaria. Considerato il ruolo ancora oggi svolto dai composti chimici, come strumento per il controllo di numerosi pests, l'insorgenza della resistenza metabolica contro diversi insetticidi rappresenta un problema dal punto di vista del controllo d’insetti dannosi, da cui deriva il rischio di un’intensificazione nell’utilizzo degli stessi insetticidi, quindi problematiche ecologiche. Tra i principali meccanismi molecolari, appartenenti al complesso del defensoma chimico, vi sono gli ABC trasportatori, proteine integrali di membrana, atte a disintossicare la cellula da diversi composti nocivi con cui questa entra in contatto. Essi agiscono come prima linea di difesa nelle cellule esposte a uno stress chimico, trasportando le molecole tossiche all’esterno della cellula e riducendone di conseguenza la concentrazione intracellulare necessaria per provocare il danno all’organismo. Gli ABC trasportatori, ben noti e ampiamente indagati in altri animali, hanno suscitato interesse per quanto riguarda gli artropodi solo negli ultimi anni. Al momento, le indagini svolte hanno chiarito solo in parte il ruolo svolto da questi trasportatori nel complesso del defensoma, rimangono quindi diversi interrogativi irrisolti. Questo progetto di dottorato si pone come primo obiettivo quello d’indagare approfonditamente il ruolo di queste proteine di detossificazione e la loro risposta, in termini di espressione genica, all’insetticida di sintesi piretroide, permetrina, in due specie di zanzara vettrici di malaria, Anopheles stephensi e Anopheles gambiae sensu stricto. Una volta determinati i geni maggiormente coinvolti nei processi di detossificazione, si è posto come secondo obiettivo quello di sviluppare sistemi d’inibizione dell’espressione genica al fine di garantire una concentrazione adeguata dell’insetticida, in sede intracellulare, da cui deriverebbero sia un’intensificazione dell’azione dell’insetticida, sia la mancata realizzazione di condizioni di sotto-dosaggio, potenzialmente favorevoli all’insorgenza di resistenze. Per quanto riguarda An. stephensi, le ricerche hanno potuto trovare una base solida ed un background di confronto in lavori precedenti, in cui il grado di attivazione di un selezionato “pacchetto” di geni era già stato evidenziato in larve, in risposta al piretroide, a diversi tempi. Nel presente studio dunque abbiamo voluto indagare il pattern d’espressione degli stessi geni (sei, appartenenti alle sottofamiglie ABCB, ABCC, ABCG), correlato al tasso di mortalità, nello stadio adulto di An. stephensi, maschi e femmine, sottoposti al trattamento con permetrina. Le diverse pressioni selettive alle quali le molteplici forme sono sottoposte potrebbero influire sui valori e la dinamicità di espressione dei trasportatori. In An. gambiae s.s. si è voluto analizzare, per la prima volta, il coinvolgimento degli stessi geni in larve, tramite duplice approccio: induzione ed inibizione aspecifica. E’ stato quindi evidenziato il pattern di espressione nel tempo di cinque geni ABC (sottofamiglie ABCB, ABCC, ABCG) dopo induzione sia con sola permetrina, sia in combinazione con un inibitore aspecifico dei trasportatori ABC (verapamil). Le indagini svolte nell’ambito del primo obiettivo hanno permesso di identificare il trasportatore ABCG4 come target promettente ai fini di un’inibizione dei meccanismi di difesa, sia in An. stephensi che in An. gambiae. Il secondo obiettivo è stato perseguito attraverso esperimenti su larve di An. stephensi. Una prima fase di studio è consistita nella realizzazione di saggi d’inibizione attraverso siRNA specie- e sequenza-specifico. I risultati ottenuti hanno consolidato l’ipotesi di un marcato coinvolgimento di ABCG4 come prima difesa contro la permetrina nelle larve di An. stephensi. La seconda fase dello studio d’inibizione ha previsto l’utilizzo di un diverso tipo di oligonucleotide antisenso (Vivo-Morpholino), caratterizzato da una maggiore stabilità ed efficacia rispetto al siRNA e dunque più adatto per un eventuale utilizzo in campo. Maggiormente rispetto al siRNA, la molecola di Vivo-Morpholino ha potenziato l’azione della permetrina, permettendo di ottenere la medesima mortalità larvale in presenza di dosi ridotte d’insetticida. In conclusione, il lavoro svolto, oltre a determinare il quadro di espressione di geni coinvolti nella detossificazione in due specie di zanzare malariche, ha percorso i primi passi verso la possibilità di sfruttare l'inibizione dell'espressione di un ABC trasportatore, per la progettazione di nuovi approcci di controllo del vettore, al fine di ridurre le dosi d’insetticidi chimici impiegati. Sarà dunque opportuno effettuare indagini più approfondite, per lo sviluppo di larvicidi e di sistemi di delivery altamente ecocompatibili e dunque fruibili per future applicazioni in campo.