A comprehensive study of adult stromal cells derived from mesenchymal tissues and their application in tendon regeneration

Il seguente progetto di ricerca ha avuto l’obiettivo di studiare in modo approfondito le cellule stromali adulte derivate da sangue periferico di cavallo e da tessuto adiposo di cane e successivamente verificare le loro potenzialità applicative nelle patologie muscolo-scheletriche, in modo particolare nella rigenerazione tendinea. Negli ultimi anni le cellule stromali adulte di derivazione mesenchimale hanno sollevato l’attenzione della comunità scientifica sia in medicina umana che veterinaria, per la potenzialità che possono rivestire nel trattamento di patologie che a tutt’oggi non trovano completa risoluzione clinica. Tuttavia nonostante i notevoli progressi fatti in questo campo di ricerca, ulteriori approfondimenti sono necessari per comprendere del tutto i diversi meccanismi delle cellule stromali adulte sia in vivo che in vitro. Questo studio ha avuto la finalità di: - Effettuare una completa ed esaustiva caratterizzazione delle cellule staminali adulte isolate a partire da sangue periferico di cavallo (ePB-MSCs) e da tessuto adiposo di cane (cA-MSCs). È stata poi indagata la possibilità di criopreservare entrambi i tipi di cellule per un anno, ed infine è stato studiato l’effetto di parametri ritenuti importanti nell’influenzare la vitalità cellulare durante la spedizione delle cellule nel breve periodo evitando il congelamento. - Indagare l’uso di cellule stromali isolate da sangue periferico e da tessuto adiposo nella rigenerazione tendinea in due diversi studi: il primo con l’obiettivo di ottenere la ricellularizzazione di uno scaffold tendineo precedentemente decellularizzato, il secondo con l’obiettivo di verificare il contributo alla rigenerazione tendinea in vivo di cellule stromali isolate da sangue periferico di pecora, immesse in lesioni sperimentali indotte con collagenasi 1A. Per l’ottenimento di una completa caratterizzazione di entrambe le ePB-MSCs e le cA-MSC è stato utilizzato il FACS sorting per analizzare l’espressione dei cluster di differenziamento (CD) presenti sulla membrana cellulare di queste cellule, inoltre è stato effettuato lo studio del tempo di duplicazione cellulare (PDT) e la positività alla fosfatasi alcalina. La potenzialità differenziativa delle ePB-MSCs e delle cA-MSCs è stata verificata mediante l’induzione al differenziamento in vitro di queste cellule verso tessuto osseo, muscolare e adiposo, e successiva verifica dell’espressione di specifici geni, quali la PPAR-y la Desmina e l’ostopontina (SPP-1) mediante PCR. Gli stessi esperimenti effettuati per definire la caratterizzazione di entrambe le ePB-MSCs e le cA-MSCs sono stati effettuati dopo un anno di criopreservazione delle stesse, concludendo che le caratteristiche di staminalità non cambiano nelle cellule stromali adulte di entrambe le specie dopo congelamento. É stata effettuata un’indagine sull’effetto che diversi mezzi di coltura, tempo e temperatura hanno sulla sopravvivenza di entrambe le ePB-MSCs e le cA-MSCs durante la spedizione nel breve periodo. Le cellule stromali di entrambe le specie sono state analizzate per l’espressione dei cluster di differenziamento, per la presenza di resistenza all’attività apoptotica e per la positività alla beta- galattosidasi. I risultati ottenuti hanno portato alla conclusione che le cellule stromali adulte possono essere spedite in soluzione salina (PBS) a temperatura ambiente per non più di 9-12 ore. Il secondo obiettivo di questo progetto di ricerca è stato finalizzato all’applicazione delle cellule stromali isolate da sangue periferico e da tessuto adiposo nella rigenerazione tendinea. Il primo lavoro effettuato ha previsto l’utilizzo di MSCs derivate da lipoaspirato umano per la ricellularizzazione di uno scaffold tendineo umano con la finalità di utilizzarlo nelle lesioni totali dei tendini flessori della mano. Lo scaffold biocompatibile è stato in precedenza decellularizzato grazie all’utilizzo di soluzioni detergenti ed enzimatiche. L’assenza di residuale materiale genomico è stata verificata tramite PCR. Questo studio ha permesso di mettere appunto una tecnica di ricellularizzazione efficiente che, avvalendosi dell’ausilio di una matrice gelificante di collagene, ha garantito una buona penetrazione cellulare all’interno della matrice dello scaffold. Il secondo lavoro effettuato sulla rigenerazione tendinea, ha avuto la finalità di paragonare l’effetto di tre diversi trattamenti (cellule stromali derivate da sangue periferico di pecora (sPB-MSCs), sPB-MSCs + platelet rich plasma (PRP), e PRP) sulla rigenerazione tendinea a 1 mese e a 4 mesi dopo lesione sperimentalmente indotta sul tendine flessore profondo delle falangi di pecora (DDFT). Dopo eutanasia delle pecore a 1 e 4 mesi i tendini sono stati analizzati tramite analisi istologica e immunoistochimica; i risultati ottenuti dopo 4 mesi hanno evidenziato una differenza significativa nel grado di riparazione tissutale tra tutti i gruppi di pecore trattate e i loro rispettivi controlli interni (lesionati, non trattati). Inoltre le pecore che hanno ricevuto il trattamento con sPB-MSCs hanno dimostrato avere il migliore processo riparativo tendineo rispetto al gruppo di pecore trattato solo con PRP per tutti i parametri istologici valutati, risultando molto più simili al tendine sano usato come controllo positivo.