Single chain antibody fragment production and metabolic engineering of hyaluronic acid in bacillus and escherichia coli

Escherichia coli è "il cavallo di battaglia" nella produzione di proteine ricombinanti per i numerosi vantaggi. E’nota la sua facilità di manipolazione con tempi brevi di duplicazione e la sua capacità di produrre grandi quantità di proteine eterologhe. Tuttavia E.coli presenta anche alcuni limiti; difficoltà possono insorgere durante l’espressione e purificazione di proteine eterologhe, quali bassi livelli di espressione, formazione di corpi di inclusione, ripiegamento proteico improprio e incapacità di formare complessi legami disolfuro. Questo è sostanzialmente dovuto alla mancanza dei prerequisiti necessari per una efficiente secrezione, a causa della struttura della membrana, del basso livello di “chaperoni” e dell’elevata concentrazione di proteasi periplasmatiche. Ospiti di espressione alternativi sono i ceppi batterici gram-positivi di Bacillus, in particolare B.subtilis e B.megaterium, classificati come organismi GRAS (generally recognized as safe) che non producono endotossine. Inoltre, rispetto a E.coli, B.subtilis e B.megaterium, possiedono un’alta capacità biosintetica e secretoria naturale con secrezione delle proteine espresse direttamente nel mezzo di coltura. Scopo del progetto era la valutazione di questi microrganismi come ospiti di espressione 1) sia per la produzione di proteine eterologhe eucariotiche, come il frammento anticorpale anti-proteina prionica 8H4 (cap I-III), 2) sia per l’ingegnerizzazione di una via metabolica naturale, quale la biosintesi dell’acido ialuronico (cap-IV). Il frammento anticorpale a catena singola (scFv) 8H4 è una complessa molecola eucariotica con tre ponti disolfuro, recentemente utilizzata nell’approccio terapeutico verso le malattie prioniche, in quanto in grado di inibire la replicazione dei prioni ritardando lo sviluppo della patologia. Nel tentativo di ottimizzare questa prospettiva terapeutica si è pensato di indirizzare il frammento anticorpale 8H4 al suo target nel sistema nervoso centrale, clonandolo in fusione con il dominio di trasduzione peptidica della proteina HIV-1 TAT, che penetra efficientemente nelle cellule traslocando attraverso la membrana plasmatica e anche la barriera ematoencefalica. Il frammento 8H4 era già stato prodotto nel nostro laboratorio in E.coli, ma con rese molto basse. In questo studio, i ceppi WB800N B.subtilis (deleto di otto proteasi extracellulari) e MS941 B.megaterium sono stati ingegnerizzati a produrre e secernere la proteina TAT-8H4. Sono stati costruiti vari vettori di espressione-secrezione, clonando la sequenza naturale TAT 8H4 o l’analoga ottimizzata per E.coli, sotto il controllo di promotori differenti (IPTG inducibile Pgrac o costitutivo forte P43 in B.subtilis, oppure xilosio-inducibile T7 in B.megaterium) in fusione con il segnale di secrezione AmyQ. Benché i ceppi di Bacillus utilizzati fossero privi di parecchie proteasi extracellulari, non siamo riusciti ad ottenere chiaramente frammento anticorpale secreto (né dopo purificazione IMAC del mezzo di coltura, né dopo precipitazione con ammonio solfato). L’anticopro era presente principalmente nella frazione intracellulare insolubile e in piccola parte nel periplasma (cap.II). Poiché l’alto potenziale secretorio di Bacillus non appariva, abbiamo provato ad incrementare le rese e la solubilità del frammento anticorpale TAT 8H4 nel citoplasma di E.coli sfruttando la tecnologia delle proteine di fusione. Allo scopo sono stati scelti il chaperone batterico DnaK e la α-sinucleina (che sembra avere attività di chaperone), per la loro azione di facilitare il ripiegamento e per le loro caratteristiche chimico-fisiche. Benché l’α-synucleina e il DnaK in fusione con TAT 8H4scFv ne incrementassero l’espressione a livelli significativi, queste proteine rimanevano largamente insolubili. Abbiamo quindi provato ad esprimerle in ceppi di E.coli ingegnerizzati per sovraesprimere i chaperoni batterici DnaKJE e GroELS, e a purificare α-synTAT8H4 dall’ambiente periplasmatico più ossidante. Poiché le rese di anticorpi di fusione in forma solubile rimanevano non significative, abbiamo purificato Dnak TAT8H4 e α-syn TAT8H4scFvs in condizioni denaturanti mediante cromatografia di affinità per ioni metallici (IMAC). Mediante processi di ripiegamento in vitro, è stato possibile ottenere in forma correttamente ripiegata solo α-syn TAT 8H4, così in grado di riconoscere la proteina prionica umana mediante immunoblotting. In cellule CHO trattate con Dnak TAT8H4 e α-syn TAT8H4, le proteine internalizzano in breve tempo, mostrando una localizzazione principalmente nucleare. Il frammento α-syn TAT8H4 è in grado di internalizzare gran parte della proteina prionica legata alla superficie cellulare, in cellule HELA transfettate con il plasmide GFP-PRP ma non con l’analogo GFP doppel. L’emivita della proteina α-syn TAT8H4 si è dimostrata superiore a quella del Dnak TAT8H4 (cap.III). In conclusione la tecnologia delle proteine di fusione si è dimostrata efficace nell’incrementare le rese di produzione di TAT8H4scFv nel citoplasma di E.coli. In fusione con il frammento anticorpale, α-sinucleina si è dimostrata preferibile a DnaK per il minor peso molecolare, le maggiori rese di produzione e la sua azione di facilitare il ripiegamento. Quindi per la sua specificità nell’eliminare in parte la proteina prionica, Escherichia coli è "il cavallo di battaglia" nella produzione di proteine ricombinanti per i numerosi vantaggi. E’nota la sua facilità di manipolazione con tempi brevi di duplicazione e la sua capacità di produrre grandi quantità di proteine eterologhe. Tuttavia E.coli presenta anche alcuni limiti; difficoltà possono insorgere durante l’espressione e purificazione di proteine eterologhe, quali bassi livelli di espressione, formazione di corpi di inclusione, ripiegamento proteico improprio e incapacità di formare complessi legami disolfuro. Questo è sostanzialmente dovuto alla mancanza dei prerequisiti necessari per una efficiente secrezione, a causa della struttura della membrana, del basso livello di “chaperoni” e dell’elevata concentrazione di proteasi periplasmatiche. Ospiti di espressione alternativi sono i ceppi batterici gram-positivi di Bacillus, in particolare B.subtilis e B.megaterium, classificati come organismi GRAS (generally recognized as safe) che non producono endotossine. Inoltre, rispetto a E.coli, B.subtilis e B.megaterium, possiedono un’alta capacità biosintetica e secretoria naturale con secrezione delle proteine espresse direttamente nel mezzo di coltura. Scopo del progetto era la valutazione di questi microrganismi come ospiti di espressione 1) sia per la produzione di proteine eterologhe eucariotiche, come il frammento anticorpale anti-proteina prionica 8H4 (cap I-III), 2) sia per l’ingegnerizzazione di una via metabolica naturale, quale la biosintesi dell’acido ialuronico (cap-IV). Il frammento anticorpale a catena singola (scFv) 8H4 è una complessa molecola eucariotica con tre ponti disolfuro, recentemente utilizzata nell’approccio terapeutico verso le malattie prioniche, in quanto in grado di inibire la replicazione dei prioni ritardando lo sviluppo della patologia. Nel tentativo di ottimizzare questa prospettiva terapeutica si è pensato di indirizzare il frammento anticorpale 8H4 al suo target nel sistema nervoso centrale, clonandolo in fusione con il dominio di trasduzione peptidica della proteina HIV-1 TAT, che penetra efficientemente nelle cellule traslocando attraverso la membrana plasmatica e anche la barriera ematoencefalica. Il frammento 8H4 era già stato prodotto nel nostro laboratorio in E.coli, ma con rese molto basse. In questo studio, i ceppi WB800N B.subtilis (deleto di otto proteasi extracellulari) e MS941 B.megaterium sono stati ingegnerizzati a produrre e secernere la proteina TAT-8H4. Sono stati costruiti vari vettori di espressione-secrezione, clonando la sequenza naturale TAT 8H4 o l’analoga ottimizzata per E.coli, sotto il controllo di promotori differenti (IPTG inducibile Pgrac o costitutivo forte P43 in B.subtilis, oppure xilosio-inducibile T7 in B.megaterium) in fusione con il segnale di secrezione AmyQ. Benché i ceppi di Bacillus utilizzati fossero privi di parecchie proteasi extracellulari, non siamo riusciti ad ottenere chiaramente frammento anticorpale secreto (né dopo purificazione IMAC del mezzo di coltura, né dopo precipitazione con ammonio solfato). L’anticopro era presente principalmente nella frazione intracellulare insolubile e in piccola parte nel periplasma (cap.II). Poiché l’alto potenziale secretorio di Bacillus non appariva, abbiamo provato ad incrementare le rese e la solubilità del frammento anticorpale TAT 8H4 nel citoplasma di E.coli sfruttando la tecnologia delle proteine di fusione. Allo scopo sono stati scelti il chaperone batterico DnaK e la α-sinucleina (che sembra avere attività di chaperone), per la loro azione di facilitare il ripiegamento e per le loro caratteristiche chimico-fisiche. Benché l’α-synucleina e il DnaK in fusione con TAT 8H4scFv ne incrementassero l’espressione a livelli significativi, queste proteine rimanevano largamente insolubili. Abbiamo quindi provato ad esprimerle in ceppi di E.coli ingegnerizzati per sovraesprimere i chaperoni batterici DnaKJE e GroELS, e a purificare α-synTAT8H4 dall’ambiente periplasmatico più ossidante. Poiché le rese di anticorpi di fusione in forma solubile rimanevano non significative, abbiamo purificato Dnak TAT8H4 e α-syn TAT8H4scFvs in condizioni denaturanti mediante cromatografia di affinità per ioni metallici (IMAC). Mediante processi di ripiegamento in vitro, è stato possibile ottenere in forma correttamente ripiegata solo α-syn TAT 8H4, così in grado di riconoscere la proteina prionica umana mediante immunoblotting. In cellule CHO trattate con Dnak TAT8H4 e α-syn TAT8H4, le proteine internalizzano in breve tempo, mostrando una localizzazione principalmente nucleare. Il frammento α-syn TAT8H4 è in grado di internalizzare gran parte della proteina prionica legata alla superficie cellulare, in cellule HELA transfettate con il plasmide GFP-PRP ma non con l’analogo GFP doppel. L’emivita della proteina α-syn TAT8H4 si è dimostrata superiore a quella del Dnak TAT8H4 (cap.III). In conclusione la tecnologia delle proteine di fusione si è dimostrata efficace nell’incrementare le rese di produzione di TAT8H4scFv nel citoplasma di E.coli. In fusione con il frammento anticorpale, α-sinucleina si è dimostrata preferibile a DnaK per il minor peso molecolare, le maggiori rese di produzione e la sua azione di facilitare il ripiegamento. Quindi per la sua specificità nell’eliminare in parte la proteina prionica, α-syn TAT8H4 scFv potrebbe essere efficace nel trattamento delle malattie spongiformi trasmissibili. Inoltre l’utilizzo di anticorpi permeabili alle cellule grazie al dominio di traslocazione TAT, eviterebbe le questioni etiche e di salute riguardanti l’applicazione della tecnologia del DNA ricombinante alla terapia clinica umana, e potrebbe essere esteso al trattamento di altre patologie. La seconda parte di questo studio riguarda l’ingegnerizzazione di una via metabolica naturale, quale la biosintesi di acido ialuronico. Nel nostro progetto la via metabolica di sintesi dell’acido ialuronico, presente in produttori naturali come gli streptococchi, è stata adattata a Bacillus. I geni coinvolti nella via metabolica biosintetica degli zuccheri precursori che in Bacillus subtilis sono dispersi nel genoma, sono stati associati in un unico mRNA policistronico assieme alla ialuronato sintasi da Streptococcus equi, come nella via naturale di produzione negli streptococchi. Abbiamo sviluppato parecchi vettori epitomali con i geni sotto il controllo di promotori forti e inducibili. Questo sistema di espressione, che utilizza plasmidi con un numero di copie relativamente alto, ha il vantaggio di esprimere livelli di mRNA maggiori rispetto ad un sistema integrativo sul cromosoma. Mediante amplificazione PCR dei geni hasA e tuaD rispettivamente da S.zooepidemicus e B.subtilis, e loro clonaggio nel plasmide shuttle pHT B.subtilis/E.coli sotto il controllo del promotore Pgrac, abbiamo selezionato ceppi stabili di Bacillus subtilis 1012 e WB800N metabolicamente ingegnerizzati e secernenti, acido ialuronico con pesi molecolari maggiori di 800 kDa, e con rese molto superiori ai 5g/L, attualmente prodotti industrialmente da Streptococcus, e ai dati finora pubblicati. Successivamente, per incrementare le rese e i pesi molecolari dell’acido ialuronico, abbiamo costruito e clonato le cassette-operone hasA-tuaD e hasA-tuaD-gtaB-pgi sotto il controllo del promotore inducibile T7 in B. megaterium. Poiché il sistema di espressione T7 è presente anche in E.coli, abbiamo dimostrato che cellule ricombinanti di E.coli producono acido ialuronico in quantità molto basse. Invece i ceppi di B. megaterium ingegnerizzati, nelle migliori condizioni di espressione individuate, hanno rese di circa 2g/L in fiasca, che sono molto promettenti in vista di processi di fermentazione in bioreattori. Inoltre i ceppi di B.megaterium che sovraesprimono i geni hasA-tuaD-gtaB-pgi sembrano produrre acido ialuronico con peso molecolare maggiore, circa 1800 kDa, comparabile anche per polidispersione agli standard commerciali di Streptococcus, suggerendo che la sovraespressione di gtaB-gpi influisce sui pesi molecolari incrementandoli, con produzione di acido ialuronico a catena più lunga (cap.IV). In conclusione se da una parte l’alto potenziale secretorio di Bacillus non si è manifestato nella secrezione di una proteina eterologa, quale il frammento anticorpale anti-PrP TAT8H4 scFv, B. subtilis and B.megaterium si sono rivelati ospiti di espressione superiori per l’ingenerizzazione di una via metabolica naturale, quale la biosintesi di acido ialuronico, sulla base di diversi criteri:1) buona qualità dell’acido ialuronico, comparabile per massa molecolare e polidispersione agli standard commerciali di Streptococcus e superiore per resa. 2) Inoltre, a differenza di Streptococcus, l’acido ialuronico prodotto da B. subtilis e B.megaterium non contiene tossine e non è associato alle cellule, ma secreto direttamente nel mezzo, semplificando i processi di purificazione. 3) Infine, mentre Streptococcus richiede mezzi complessi per la crescita, i ceppi di Bacillus crescono su terreni minimi, garantendo prodotti finali più puri ad esenti da tossine. α-syn TAT8H4 scFv potrebbe essere efficace nel trattamento delle malattie spongiformi trasmissibili. Inoltre l’utilizzo di anticorpi permeabili alle cellule grazie al dominio di traslocazione TAT, eviterebbe le questioni etiche e di salute riguardanti l’applicazione della tecnologia del DNA ricombinante alla terapia clinica umana, e potrebbe essere esteso al trattamento di altre patologie. La seconda parte di questo studio riguarda l’ingegnerizzazione di una via metabolica naturale, quale la biosintesi di acido ialuronico. Nel nostro progetto la via metabolica di sintesi dell’acido ialuronico, presente in produttori naturali come gli streptococchi, è stata adattata a Bacillus. I geni coinvolti nella via metabolica biosintetica degli zuccheri precursori che in Bacillus subtilis sono dispersi nel genoma, sono stati associati in un unico mRNA policistronico assieme alla ialuronato sintasi da Streptococcus equi, come nella via naturale di produzione negli streptococchi. Abbiamo sviluppato parecchi vettori epitomali con i geni sotto il controllo di promotori forti e inducibili. Questo sistema di espressione, che utilizza plasmidi con un numero di copie relativamente alto, ha il vantaggio di esprimere livelli di mRNA maggiori rispetto ad un sistema integrativo sul cromosoma. Mediante amplificazione PCR dei geni hasA e tuaD rispettivamente da S.zooepidemicus e B.subtilis, e loro clonaggio nel plasmide shuttle pHT B.subtilis/E.coli sotto il controllo del promotore Pgrac, abbiamo selezionato ceppi stabili di Bacillus subtilis 1012 e WB800N metabolicamente ingegnerizzati e secernenti, acido ialuronico con pesi molecolari maggiori di 800 kDa, e con rese molto superiori ai 5g/L, attualmente prodotti industrialmente da Streptococcus, e ai dati finora pubblicati. Successivamente, per incrementare le rese e i pesi molecolari dell’acido ialuronico, abbiamo costruito e clonato le cassette-operone hasA-tuaD e hasA-tuaD-gtaB-pgi sotto il controllo del promotore inducibile T7 in B. megaterium. Poiché il sistema di espressione T7 è presente anche in E.coli, abbiamo dimostrato che cellule ricombinanti di E.coli producono acido ialuronico in quantità molto basse. Invece i ceppi di B. megaterium ingegnerizzati, nelle migliori condizioni di espressione individuate, hanno rese di circa 2g/L in fiasca, che sono molto promettenti in vista di processi di fermentazione in bioreattori. Inoltre i ceppi di B.megaterium che sovraesprimono i geni hasA-tuaD-gtaB-pgi sembrano produrre acido ialuronico con peso molecolare maggiore, circa 1800 kDa, comparabile anche per polidispersione agli standard commerciali di Streptococcus, suggerendo che la sovraespressione di gtaB-gpi influisce sui pesi molecolari incrementandoli, con produzione di acido ialuronico a catena più lunga (cap.IV). In conclusione se da una parte l’alto potenziale secretorio di Bacillus non si è manifestato nella secrezione di una proteina eterologa, quale il frammento anticorpale anti-PrP TAT8H4 scFv, B. subtilis and B.megaterium si sono rivelati ospiti di espressione superiori per l’ingenerizzazione di una via metabolica naturale, quale la biosintesi di acido ialuronico, sulla base di diversi criteri:1) buona qualità dell’acido ialuronico, comparabile per massa molecolare e polidispersione agli standard commerciali di Streptococcus e superiore per resa. 2) Inoltre, a differenza di Streptococcus, l’acido ialuronico prodotto da B. subtilis e B.megaterium non contiene tossine e non è associato alle cellule, ma secreto direttamente nel mezzo, semplificando i processi di purificazione. 3) Infine, mentre Streptococcus richiede mezzi complessi per la crescita, i ceppi di Bacillus crescono su terreni minimi, garantendo prodotti finali più puri ad esenti da tossine