Dissecting the transcriptional regulatory network of seed and mesocarp development in peach

Il pesco (Prunus persica) è uno dei più importanti alberi da frutto al mondo e la specie modello per le drupacee. Lo sviluppo del frutto di pesco è caratterizzato da un stretto rapporto tra il seme e il pericarpo durante i primi stadi, seguito negli stadi successivi da un disaccoppiamento nello schema di sviluppo dovuto alla lignificazione dell’endocarpo. Le varie cultivar di pesco possono avere dei periodi di sviluppo del frutto dalla lunghezza estremamente variabile, pur avendo un seme che si sviluppa in maniera simile. Per questo, comprendere la relazione tra seme e pericarpo può chiarire il meccanismo che regola lo sviluppo del frutto nel suo complesso. L’approccio transcrittomico è uno strumento potente per analizzare questa relazione, dato che produce un gran numero di informazioni sulla trascrizione di un gran quantitativo di geni in un singolo esperimento. Il Capitolo II consiste in un articolo pubblicato che descrive l’uso dell’array µPEACH1.0 nello studiare la relazione tra seme e mesocarpo e tra stadi iniziali e finali di sviluppo nella cultivar Fantasia. Campioni di mRNA di pesco sono stati raccolti dagli stadi iniziali e finali dei due organi e ibridizzati sulle 4 806 sonde dell’array µPEACH1.0. I dati trascrittomici ottenuti da questi campioni sono stati quindi confrontati. Sono stati trovati dei geni marcatori per i quattro stadi di sviluppo del pesco (Stadio S1: divisione ed espansione cellulare nel frutto, S2: lignificazione dell’endocarpo, S3: espansione cellulare nel mesocarpo, S4: maturazione) sia per il mesocarpo che per il seme e la loro espressione confermata con la qRT-PCR: I marcatori stadio-specifici per il mesocarpo sono rispettivamente per S1, S2, S3 e S4: una proteina RD22-like, una serin-carbossipeptidasi, una proteina correlata alla senescenza e una Aux/IAA; mentre per il seme sono, rispettivamente: una proteina trasportatrice di lipidi (LTP1), una proteina correlata alla patogenesi (PR), una prunina e una proteina LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT (LEA). La qRT-PCR ha confermato che questi geni sono marcatori anche in una cultivar precoce (SpringCrest) e in un genotipo a maturazione lenta (slr). Quindi i dati sono stati analizzati con lo strumento HORMONOMETER al fine di misurare indirettamente il quantitativo relativo di ormoni nei vari organi e stadi di sviluppo. E’ emerso che l’auxina, le citochinine e le gibberelline possono essere coinvolte nella segnalazione durante l’inizio dello sviluppo, quando vi è comunicazione tra i due organi. Il Capitolo III è un articolo non pubblicato nel quale viene descritto come venga utilizzata una nuova piattaforma microarray (µPEACH3.0) nello studiare lo sviluppo del seme e del mesocarpo di pesco. La recente pubblicazione del genoma di pesco ha permesso lo sviluppo di un microarray che copre l’intero genoma, superando così il problema di avere un array che misura l’espressione genica solo di una parte del genoma. Rispetto allo studio descritto nel Capitolo I, anche il numero di campioni è stato incrementato: sono state usate tre repliche biologiche per sei diversi momenti per ciascuno dei due organi, dando così una visuale più vasta sullo sviluppo di questi due tessuti. L’array µPEACH3.0 ha funzionato bene, dando una correlazione con i dati di qRT-PCR pari a 0.77, un numero simile a quello trovato per altri array. I dati trascrittomici hanno facilmente distinto i due tessuti e i sei campionamenti, come mostrato dall’analisi delle componenti principali. Il 69% delle sonde ha prodotto un segnale significativo in almeno uno dei campioni, ciò nonostante, considerando che il numero di sonde funzionanti decresce se si prende in considerazione un solo tessuto, è probabile che testando il microarray con mRNA proveniente da altri tessuti (come le foglie o le radici) aumenti il numero di segnali significativi provenienti dall’array. L’analisi globale dell’attività genica è stata indirizzata ai primi stadi di sviluppo. I dati hanno permesso di indentificare parecchi geni coinvolti nei processi del ciclo cellulare che si verificano all’inizio dello sviluppo sia del mesocarpo che del seme. In particolare, è stato trovate che geni della famiglia TITAN sono attivi nel seme contenente endosperma. L’analisi dei geni del ciclo cellulare nel mesocarpo ha mostrato l’esistenza di due diversi profili di espressione: mentre i geni relativi alla mitosi erano espressi solo nello stadio S1, i geni della replicazione del DNA hanno mostrato un doppio picco di espressione, in S1 e poi in S3/S4, suggerendo che in questi stadi possono verificarsi eventi di endoreduplicazione. Con l’utilizzo di qRT-PCR, i livelli d’esrpessione di questi geni sono stati testati anche in altre cultivar; i dati ottenuti suggeriscono che nel genotipo slr la mancanza di endoreduplicazione possa essere coinvolta nel basso tasso di crescita durante lo stadio S3 di questo genotipo. Sono stati quindi valutati i profili d’espressione di famiglie di fattori di trascrizione (FT), dato che si ritiene che i fattori di trascrizione siano le proteine con i ruoli più importanti nella regolazione durante lo sviluppo. E’ stato trovato che FT delle famiglia SQUAMOSA promoter Binding Protein (SBP) hanno un alto livello di espressione all’inizio dello sviluppo di entrambi gli organi considerati, il quale successivamente diminuisce velocemente. E’ stato scoperto che nel seme maturo è indotta la trascrizione di FT di tipo Growth-Regulating Factor (GRF). Questi dati sono stati confermati con l’utilizzo di qRT-PCR in ‘SpringCrest’ precoce e nel genotipo a lenta maturazione slr. Dato che in altre specie vegetali l’abbondanza dell’mRNA di geni appartenenti a queste famiglie di FT è regolata da microRNA (miRNA) specifici, è stata misurata l’espressione degli omologhi di pesco di questi miRNA. In tre diverse cultivar è stata trovata una correlazione negativa nel contenuto di RNA per le seguenti coppie microRNA/FT: miR156/SBP, miR396/GRF e mir167/ARF8, suggerendo non solo che questi miRNA posseggono la stessa attività un pesco, ma anche che i miRNA sono profondamente coinvolti nella rete regolativa sottostante lo sviluppo del frutto di pesco. In appendice vi è uno studio pubblicato nel quale viene descritto l’uso di µPEACH3.0 nello studiare gli effetti delle ferite su due cultivar con diversa tolleranza a questo stress. Sono stati utilizzati campioni di RNA estratti da mesocarpi feriti o intatti della cultivar “melting” Glohaven (GH) e della cultivar “slow melting” BigTop (BT). I dati trascrittomici, confermati dall’analisi tramite qRT-PCR, hanno mostrato il coinvolgimento di fattori di trascrizione di tipo WRKY, AP2/ERF, e HSP20 nella risposta di GH alla ferite. Insieme a questi, è stato trovato che nel mesocarpo ferito di GH viene indotta l’espressione anche di geni coinvolti nella risposta agli stress, nel metabolismo della parete cellulare, nella biosintesi dei fenilpropanoidi e triterpenoidi.