The strange case of protein kinase CK2: how a constitutively active enzyme can mediate signal transduction. Lo strano caso della proteinchinasi CK2: come un enzima costitutivamente attivo può mediare la trasduzione del segnale.

Riassunto La proteinchinasi CK2 è un Ser/Thr chinasi composta da due subunità catalitiche (alfa e/o alfa') e due subunità regolatorie (beta). E' ubiquitaria, costitutivamente attiva e altamente pleiotropica con più di 300 substrati noti sino ad oggi (Meggio e Pinna, 2003); proprio per queste sue caratteristiche, CK2 gioca un ruolo chiave in molti processi fisiologici e patologici (Pinna, 2002; Ahmed et al., 2002). Diversamente dalla maggior parte delle altre chinasi, che in risposta a stimoli specifici sono attivate da secondi messaggeri, fosforilazioni o associazione con molecole regolatorie, l’attività di CK2 non è regolata, e questo rende particolarmente impegnativa la comprensione dei meccanismi tramite i quali essa controlla i diversi processi cellulari. Molti degli sforzi al riguardo sono diretti all’identificazione di substrati cellulari responsabili del suo intervento in tali processi. Queste considerazioni ed il fatto che è largamente riconosciuto il ruolo anti-apoptotico e pro-sopravvivenza che CK2 riveste nelle cellule, quindi legato alla trasformazione neoplastica (Ruzzene e Pinna, 2010), hanno reso CK2 un interessante bersaglio farmacologico nelle varie patologie nelle quali è stata riconosciuta avere un ruolo (Guerra e Issinger, 2008). Sono stati infatti sviluppati molti inibitori specifici per CK2, non solo allo scopo di studiare il suo ruolo fisiologico, ma anche, potenzialmente, per uso terapeutico (Sarno e Pinna, 2008; Pierre et al., 2011). La domanda principale che ha dato origine a questo lavoro di tesi è stata quindi: come può una chinasi costitutivamente attiva mediare stimoli esterni, che, per loro nature, devono essere transitori? Con queste premesse, abbiamo quindi studiato il coinvolgimento di CK2 in differenti contesti e vie di segnalazione. I tre principali argomenti descritti in questa tesi sono: I. Ruolo di CK2 nel differenziamento di cellule di leucemia promielocitica acuta (APL) in risposta ad acido retinoico (RA); II. Ruolo di CK2 nella risposta delle piante al trattamento con acido salicilico (SA); III. Regolazione da parte di CK2 di complessi chaperone multimolecolari, in condizioni di sopravvivenza ed apoptosi, in cellule normali e farmacoresistenti (MDR) I. Ruolo di CK2 nel differenziamento di cellule di leucemia promielocitica acuta (APL) in risposta ad acido retinoico (RA): Con questo lavoro, abbiamo dimostrato che l’attività di CK2 è necessaria per il differenziamento indotto da RA delle cellule di leucemia promielocitica acuta, infatti l’inibizione di CK2 blocca tale risposta cellulare. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’attività catalitica di CK2 non è influenzata dal trattamento; abbiamo pertanto focalizzato la nostra attenzione su possibili variazioni di fosforilazione dei suoi substrati. Il principale cambiamento èstato osservato nel grado di fosforilazione della beta-actina, una proteina mai annoverata sino ad ora tra i substrati di CK2. Attraverso saggi di fosforilazione in vitro, abbiamo confermato che l’actina è effettivamente un substrato di CK2. Abbiamo potuto inoltre appurare che il trattamento con RA induce un aumento dell’espressione della beta-actina, individuabile sia a livello citosolico che nucleare; particolarmente interessante è risultato il fatto che l’inibizione di CK2 riduce fortemente tale incremento a livello nucleare, suggerendo un ruolo della fosforilazione di CK2 nella traslocazione della beta-actina nel nucleo e, di conseguenza, la sua possibile importanza nel mediare l’effetto di RA sul differenziamento delle cellule APL. II. Ruolo di CK2 nella risposta delle piante al trattamento con acido salicilico (SA); Il trattamento con SA, nelle piante, è noto indurre una risposta di varia natura, accompagnata dalla produzione di ossido nitrico (NO), che viene però a mancare qualora CK2 sia inibita (Zottini et al., 2007). Con questo studio in Arabidopsis, abbiamo dimostrato che la principale proteina che viene fosforilata in risposta al trattamento con SA, è p23, una proteina omologa alla p23 umana che è un co-chaperone noto per essere coinvolto, con Hsp90, nel macchinario delle “chaperonine”. I nostri risultati hanno dimostrato che CK2 (umana e di mais) fosforilano p23 di Arabidopsis in vitro con parametri cinetici favorevoli, e inoltre, che la CK2 endogena di Arabidosis è la principale chinasi responsabile della fosforilazione di questa proteina. Abbiamo anche dimostrato che CK2 e p23 possono interagire fisicamente in vitro e che hanno, in vivo, la stessa localizzazione subcellulare. Al momento non conosciamo la funzione di p23 e l’effetto della sua fosforilazione, ma, nell’insieme, i nostri dati sono coerenti con un suo ruolo nel mediare l’azione di CK2, in risposta all’SA nelle piante. III. Regolazione da parte di CK2 di complessi chaperone multimolecolari, in condizioni di sopravvivenza ed apoptosi, in cellule normali e farmacoresistenti (MDR): In questo lavoro ci siamo serviti del modello cellulare costituito dalle cellule CEM, che avevamo disponibili in due varianti: le S-CEM, che sono sensibili all’apoptosi indotta da farmaci, e le R-CEM, che sono invece farmacoresistenti (Dupuis et al., 2003). Questo modello è particolarmente interessante, in quanto abbiamo dimostrato in precedenza che le cellule R-CEM esprimono un livello più elevato della subunità catalitica di CK2 rispetto alle S-CEM. In queste cellule, abbiamo analizzato un substrato specifico di CK2, la proteina co-chaperone Cdc37, che è essenziale nel macchinario chaperone di Hsp90 diretto al folding ed all’attivazione di proteinchinasi. Abbiamo visto che le due linee cellulari esprimono due isoforme diverse di Cdc37: le S-CEM esprimono una isoforma più corta al C-terminale rispetto all’isoforma presente nelle R-CEM. Le due isoforme dimostrano inoltre di avere caratteristiche diverse: quella delle S-CEM è rapidamente degradata in apoptosi, mentre l’isoforma delle R-CEM è più stabile e, in apoptosi, è sottoposta al taglio del solo C-terminale. Sorprendentemente però, nonostante l’elevata espressione di CK2, nelle R-CEM, il livello della fosfo-Ser13, che è il residuo fosforilato in maniera specifica da CK2 in Cdc37, non è significativamente diverso nelle due linee cellulari. Questo ci ha suggerito l’ipotesi che, a seconda dell’isoforma espressa, la Ser13 sia diversamente accessibile alla chinasi e/o alla fosfatasi responsabili della sua modificazione. In accordo con ciò, abbiamo infatti osservato che in apoptosi, quando il C-terminale di Cdc37 delle R-CEM viene tagliato, si assiste anche alla defosforilazione della Ser13. Inoltre, le due isoforme sembrano partecipare a complessi multimolecolari diversi, come appurato tramite centrifugazione in gradiente di densità, che mostrano anche una diversa sensibilità alla disgregazione indotta da inibitori degli chaperone. Nel complesso, i dati ottenuti suggeriscono che CK2, nelle cellule farmacoresistenti, dove è espressa a livelli particolarmente elevati, può servirsi di Cdc37, che in queste cellule sembra essere più funzionale, come un potente strumento per esplicare la sua funzione anti-apoptotica.