Volatile Organic Compounds in cheese production chain (VOCheese)

Negli ultimi anni, il consumatore è diventato sempre più sensibile agli aspetti qualitativi degli alimenti, i quali sono fortemente influenzati dalle caratteristiche sensoriali come l’aroma. Diversi lavori scientifici hanno dimostrato che i composti volatili (VOCs) rilasciati dall’alimento sono correlati con il suo aroma e possono essere considerati come traccianti delle filiere alimentari. Oggi, l’analisi dei VOCs richiede strumenti rapidi, sensibili, non invasivi e che abbiano bisogno dell’impiego di pochi solventi durante la preparazione del campione. E’ stato dimostrato che i VOCs possono essere estratti, misurati e identificati con la Gas Cromatografia di Massa (GC-MS) senza pre-concentrazioni o pre-trattamenti dell’alimento da analizzare. Gli obiettivi principali della tesi di dottorato erano di studiare la presenza di composti volatili nei prodotti lattiero-caseari. Più precisamente, questo studio aveva come obiettivi di i) qualificare e quantificare i VOCs nei prodotti lattiero-caseari, ii) esaminare la loro formazione e iii) integrare le conoscenze acquisite su questi composti attraverso tutta la filiera di produzione dalla materia prima fino al prodotto finito. Inoltre, analisi statistiche sono state utilizzate per collegare i VOCs con la caratterizzazione genetica degli animali, il sistema di allevamento e le caratteristiche individuali delle vacche (es. stadio di lattazione, ordine di parto e produzione giornaliera di latte). L’identificazione e la quantificazione dei VOCs sono state fatte utilizzando tecniche analitiche precise, veloci e non invasive (Solid Phase Micro Extraction/Gas Chromatography-Mass Spectrometry SPME/GC-MS and Proton Transfer Reaction-Time of Flight-Mass Spectrometry PTR-ToF-MS). Per rispondere agli obiettivi generali della tesi, l’attività di ricerca è stata divisa in cinque parti connesse tra di loro. L’obiettivo nel primo capitolo era di studiare i composti volatili presenti nello spazio di testa di campioni di formaggio. Per questo scopo, sono stati analizzati 150 formaggi stagionati per due mesi. I formaggi sono stati prodotti utilizzando una metodica di caseificazione individuale usando latte individuale di vacche di razza Bruna. Gli animali sono stati allevati in 30 aziende appartenenti a diversi sistemi di allevamento, da tradizionale (tipico della realtà montana) a moderno. In questo studio sono stati identificati 55 VOCs per ogni formaggio, classificati in diverse famiglie chimiche: acidi grassi, esteri, alcoli, aldeidi, chetoni, lattoni, terpeni e pirazine. Dai risultati emerge che il sistema di allevamento e le caratteristiche individuali delle vacche (stadio di lattazione, ordine di parto e produzione giornaliera di latte) influenzano i composti volatili. Inoltre, per testare la riproducibilità dello strumento e della metodica di caseificazione; la data di analisi cromatografica, l’ordine d’iniezione del campione nello strumento (GC), e la caldaia di caseificazione erano inclusi nel modello statistico. In molti casi, questi fattori analitici/strumentali non influenzano la quantità di VOCs rilasciata dai formaggi. Nel secondo capitolo, il potenziale di una nuova tecnica analitica (PTR-ToF-MS) è stato approfondito per studiare, su larga scala, le caratteristiche qualitative del formaggio. Il PTR-ToF-MS dal punto di vista analitico, permette un’iniezione diretta del campione senza estrazione o pre-concentrazione, ha un breve tempo di analisi (solo pochi secondi per campione) e grande sensibilità consentendo di monitorare in tempo reale l’evoluzione dei composti volatili. L’analisi produce uno spettro molto dettagliato che può essere utile per la caratterizzazione delle qualità e della tipicità dell’alimento. In particolare, è stata analizzata l’impronta aromatica di 1,075 formaggi prodotti utilizzando latte individuale di vacche di razza Bruna allevate in 72 aziende appartenenti a diversi sistemi di allevamento. L’impronta aromatica (spettro) era caratterizzata da più di 600 picchi (variabili) per ogni formaggio. Gli spettri sono stati analizzati e dopo la rimozione degli ioni interferenti e del rumore di fondo è stato selezionato un data set costituito da 240 picchi per ogni formaggio. In seguito, basandosi sui risultati del primo contributo e sulla letteratura sono stati identificati i picchi più importanti (61) in termini quantitativi e qualitativi. Per sintetizzare la quantità di informazioni ovvero estrarre delle componenti principali (PC) è stata fatta un’analisi multivariata (PCA) a partire dai 240 picchi spettrometrici. In seguito, le PCs sono state caratterizzate sulla base delle loro correlazioni con i 240 picchi spettrometrici. Sono stati analizzati gli effetti del sistema di allevamento, dell’azienda entro sistema di allevamento, le caratteristiche individuali delle vacche (stadio di lattazione, ordine di parto e produzione di latte), e caldaia di caseificazione sulle PCs e sui 240 picchi. Dai risultati emerge che il sistema di allevamento è correlato con le PC e 57 picchi, specialmente quando le aziende come tecnica di alimentazione utilizzano il carro miscelatore (TMR) con e senza insilati nella dieta. Considerando le caratteristiche individuali delle vacche, l’effetto più significativo è lo stadio di lattazione (139 picchi), seguito dalla produzione di latte e dall’ordine di parto, con 31 e 21 picchi, rispettivamente. Infine, la caldaia di caseificazione è un effetto spesso non significativo, confermando la buona riproducibilità della micro-caseificazione utilizzata anche per lo studio di aspetti qualitativi del formaggio. Nel terzo capitolo è stato studiato l’effetto della genetica dell’animale sui composti volatili dei formaggi. A tale scopo, sono state analizzate le componenti principali (estratte come discusso sopra nel secondo contributo) e i 240 picchi spettrometrici (PTR-ToF-MS) utilizzando un modello animale con un approccio Baesiano. Dai risultati emerge in media un’ereditabilità (h2) del 7 % per le componenti principali, la quale è simile all’h2 trovata per le cellule somatiche e leggermente più bassa di quella del contenuto di grasso nel latte e della produzione giornaliera di latte stimate in precedenza sugli stessi animali. E’ interessante osservare che solo una piccola quantità di picchi ha una bassa h2 (<7%). La maggior parte di essi presenta valori simili a quelli trovati per le PCs, mentre 40 picchi presentano ereditabilità simile a quella trovata per la produzione giornaliera di latte e ad altre caratteristiche qualitative del latte. La variabilità attribuita all'azienda è risultata diversa per le PCs. Questi risultati dimostrano che esiste un’interessante variabilità genetica di alcuni VOCs che potrebbe essere potenzialmente utilizzata nei programmi di miglioramento genetico. L’obiettivo nel quarto capitolo era di studiare l’effetto della transumanza sulle caratteristiche qualitative di prodotti lattiero-caseari. Vista la grande mole di dati, questo contributo è stato diviso in due parti tra loro connesse. Nella prima parte è stata studiata l’evoluzione della qualità del latte e del formaggio, mentre nella seconda parte è stata analizzata l’evoluzione dei composti volatili dei prodotti lattiero-caseari nel processo di caseificazione. Nella prima parte, sono state analizzate le proprietà fisiche, chimiche e tecnologiche di 11 prodotti lattiero-caseari raccolti durante la transumanza al pascolo Alpino (Malga) di vacche da latte. E’ risaputo che i prodotti ottenuti durante il periodo di alpeggio possono avere un valore aggiunto dovuto alle elevate proprietà nutrizionali, salutistiche e aromatiche. Per approfondire le conoscenze finora acquisite, è stata fatta questa prova in cui è stato utilizzato il latte di massa prodotto da 148 vacche allevate giorno e notte al pascolo (1,860 m s.l.m.). Durante l’esperimento, sono state fatte 7 caseificazioni seguendo tecniche tradizionali, una ogni 2 settimane, utilizzando il latte prodotto durante la transumanza (da giugno a settembre). Sono stati raccolti per ogni caseificazione: il latte della mungitura della sera (giorno prima della caseificazione), lo stesso latte il mattino successivo (dopo il processo di scrematura naturale), la panna di affioramento, il latte della mungitura del mattino, il latte in caldaia ottenuta dalla miscela tra il latte scremato della mungitura della sera con il latte della mungitura del mattino, la cagliata, il siero, la ricotta ottenuta dal siero e il residuo della lavorazione ossia la scotta. Inoltre, la cagliata è stata usata per produrre formaggi di “Malga” che sono stati stagionati per 6 e 12 mesi. Le caratteristiche chimico-fisiche sono state misurate con una tecnologia a infrarosso. I risultati dimostrano una variazione della produzione giornaliera e composizione chimica del latte, resa in formaggio e recupero/o perdita di nutrienti nel processo di caseificazione tradizionale. In particolare, si è osservata una riduzione della produzione giornaliera di latte, grasso, proteine e lattosio del latte durante la transumanza estiva. Tuttavia, si è anche osservato un effetto positivo sulla produzione e la composizione chimica del latte del ritorno delle vacche nelle aziende di fondo valle alla fine della stagione dell’alpeggio. La resa media di formaggio in questo lavoro è risultata del 14.2%, mentre i recuperi di grasso, proteine, solidi totali ed energia sono del 85.1%, 77.8%, 49.4% e 58.1%, rispettivamente. Questi risultati sono in linea con quelli trovato in letteratura. Nella seconda parte di questo contributo, è stato misurato il contenuto di composti volatili nello spazio di testa dei campioni con la tecnica SPME/GC-MS. Dopo l’analisi, sono stati identificati 49 VOCs appartenenti alle famiglie chimiche degli alcoli, aldeidi, acidi grassi, chetoni, esteri, lattoni, terpeni e composti solforati e fenolici. Inoltre, è stata studiata l’evoluzione dei VOCs e delle loro famiglie chimiche attraverso i processi di caseificazione, di produzione della ricotta e di stagionatura del formaggio. Il confronto tra la concentrazione dei VOCs dei 4 tipi di latte (intero e scremato della sera, intero del mattino, caldaia) ha dimostrato che il processo di scrematura influenza la concentrazione di metà dei composti volatili analizzati, seguito dall’effetto della mungitura (intero della sera vs. intero del mattino) e dall’effetto del mescolamento (latte scremato della sera mescolato in parti uguali con il latte del mattino). In generale, la panna, rispetto a cagliata e ricotta, ha un maggiore contenuto di acidi grassi, terpeni e composti solforati. Inoltre, la ricotta rispetto alla cagliata ha un’elevata concentrazione di VOC, probabilmente dovuta alla maggiore temperatura utilizzata durante il processo di produzione. L’effetto del progressivo depauperamento di nutriente del latte è stato studiato attraverso il confronto tra latte in caldaia, siero e scotta. Sebbene il latte abbia un maggiore contenuto di nutrienti, il siero e la scotta hanno una maggiore concentrazione di VOC ad eccezione delle famiglie chimiche degli esteri, terpeni, composti solforati e fenolici. Infine, l’effetto della maturazione è stato valutato attraverso il confronto tra le quantità di VOC della cagliata e dei formaggi stagionati (6 e 12 mesi). Il rilascio dei composti volatili incrementa con l’aumento del periodo di maturazione probabilmente dovuto a una maggiore attività enzimatica e microbiologica nel formaggio. In conclusione, le tecniche analitiche di spettrometria di massa utilizzate in questo lavoro (SPME/GC-MS e PTR-ToF-MS) hanno permesso di caratterizzare i composti volatili dei prodotti lattiero-caseari in maniera efficiente. Il sistema di allevamento, le caratteristiche individuali delle vacche hanno influenzato l’impronta aromatica di formaggi individuali stagionati. In particolare, riguardo alle caratteristiche individuali degli animali il principale effetto era lo stadio di lattazione seguito da ordine di parto e produzione giornaliera di latte. Sulla base dei fenotipi raccolti in questo lavoro è stato possibile effettuare un’analisi genetica, la quale ha dimostrato l’esistenza di un’interessante variabilità genetica connessa ai composti volatili del formaggio che potrebbe essere utile per una selezione (in)diretta delle vacche da latte sulla base di aspetti qualitativi in programmi di miglioramento genetico. Tuttavia sono necessarie altre ricerche in quest’area per esempio, nell’era della genomica, sarebbe interessante associare qualche regione specifica del genoma ai composti volatili. L’evoluzione dei composti volatile attraverso la filiera di produzione dipende da specifici aspetti tecnologici, come l’affioramento della panna, la temperatura di coagulazione e il periodo di stagionatura. Il monitoraggio dell’impronta aromatica permette di ottenere prodotti lattiero-caseari con delle specifiche caratteristiche organolettiche utili a differenziare il prodotto sul mercato e a migliorare l’efficienza dell’intera filiera produttiva sulla base di aspetti qualitativi.