STUDIO DI ENZIMI D’INTERESSE MEDICO ED INDUSTRIALE

Tre principali progetti sono stati condotti durante il periodo di dottorato. Due di questi consistono nell’individuazione di enzimi utili a catalizzare passaggi intermedi o finali nella sintesi di principi attivi; il terzo riguarda l’espressione ricombinante della tirosinasi umana, la sua parziale purificazione e caratterizzazione. Nel primo progetto, in collaborazione con Fabbrica italiana sintetici (FIS) è stato individuato un passaggio critico nella sintesi di un building block della Moxifloxacina e n’è stata proposto un’alternativa via enzimatica che prevede la risoluzione di una miscela racemica di un diestere precursore. A questo scopo è stato ricercato un enzima che fosse in grado di idrolizzare selettivamente uno dei due enantiomeri al fine di generare la relativa forma acida enantiomericamente pura, facilmente separabile dall’enantiomero non reagito, ed utilizzare successivamente l’enantiomero con configuraione desiderata per la preparazione del (4as,7as)-ottaidro-1H-pirrolo[3,4-b]piridina, elemento costitutivo della Moxifloxacina. Dopo aver testato diversi enzimi commerciali, già utilizzati in letturatura per effettuare risoluzioni racemiche, ed utilizzando diversi approcci analitici (tecniche NMR e HPLC-MS), è stato identificato con successo nell’enzima lipasi B di Candida Antarctica un valido strumento per idrolizzare selettivamente una miscela racemica di dimetil 1-acetilpiperidina-2,3-dicarbossilato in ambiente acquoso. La selettivià enantiomerica è stata determinata mediante HPLC chirale, confermando che l’idrolisi procede solo sull’enantiomero con configurazione 2R,3S. In più l’analisi HPLC-MS ha evidenziato che solo uno dei due gruppi metilici viene idrolizzato dalla lipasi, conferendo all’enzima anche regioselettività. Il prodotto di reazione è stato ulteriormente caratterizzanto mediante tecniche NMR (COSY, HMQC, HMBC) le quali hanno indicato che l’idrolisi avviene al metile in posizione 3. Uno studio cinetico condotto mediante NMR ha poi permesso di stimare le costanti cinetiche Km e Vmax della reazione di idrolisi. L’enzima è stato utilizzato da FIS per la sintesi in scala di alcuni grammi del precursore della Moxifloxacina. Il processo è stato sottoposto a domanda di brevetto. Un secondo progetto, condotto ancora in collaborazione con FIS, si è focalizzato sul tentativo di superare un passaggio critico nella sintesi organica del testosterone (TS) che consiste in una riduzione regio- e stereo-specifica dal 4-andro-3,17-dione (AD). In accordo con la letteratura non esistono enzimi commercialmente disponibili in grado di catalizzare in modo appropriato questa trasformazione. Dal momento che sia il substrato che il prodotto sono composti naturali, è stata focalizzata la ricerca nell’individuazione di un enzima che in natura effettuasse l’analoga trasformazione. La categoria enzimatica che catalizza questa trasformazione è generalmente classificata come 17b-idrossisteroide deidrogenasi (E.C.:1.1.1.51). Tuttavia questi enzimi, nei diversi organismi, si differenziano in termini di regioselettività e velocità di catalisi. La combinazione di uno screening bioinformatico e bibliografico ha permesso di individuare due candidati che sono stati selezionati per l’espressione in forma ricominante: 17b-idrossisteroide deidrogenasi tipo 5 murina e il prodotto genico YMR226c di Saccaromiyces cereviseae. Le sequenze codificanti degli enzimi sono state clonate in vettori adatti per l’espressione in E.coli, anche in fusione con una coda di istidine. Una preparazione in piccola scala degli enzimi ricombinanti ha permesso di effettuare tests di attività sul substrato desiderato. Solo l’enzima murino ha mostrato attività nei confronti dell’AD ed è stato oggetto di ulteriori studi. Una preparazione in piccola scala ha permesso di analizzare il prodotto ottenuto dalla reazione, in termini di regio- e stereo-selettività e resa, così come la valutazione della stabilità termica dell’enzima, la preferenza per il cofattore (NADPH o NADH) e la scelta dell’adeguata frazione di cosolvente da utilizzare per incrementare la solubilità del substrato in acqua. Un protocollo di purificazione dell’enzima in scala più consistente è successivamente stato identificato e migliorato. La quantità di enzima ottenuta dalle preparazioni, in combinazione con l’utilizzo di una D-glucosio deidrogenasi commerciale, per riciclare il cofattore, ha permesso di convertire alcuni milligrammi di AD. Anche per questo processo è stato effettuata richiesta di brevetto. Il terzo pregetto riguarda l’enzima tirosinasi umano. Questo enzima è implicato in diverse patologie e rappresenta un potenziale bersaglio farmaceutico per trattare disordini nella sintesi della melanina, melanoma e patologie associate a specie ROS. L’enzima è stato espresso in due forme ricombinanti utilizzando cellule di insetto sf9 e il sistema baculovirus (Bac to Bac ®, Invitrogen), un sistema in grado di effettuare la glicosilazione. Entrambi le forme, la prima nativa e la seconda priva di sequenza segnale e regione transmembrana, sono state espresse dalle cellule ed inizialmente osservate mediante analisi western blot. Il protocollo di purificazione si è focalizzato sulla forma nativa, che appare associata alle membrane. Diversi detergenti sono stati utilizzati per solubilizzare l’enima ma solo Triton 100X, n-dodecyl-β-D-maltoside and SDS si sono dimostrati efficaci. A seguto della solubilizzazione, test di attività sono stati condotti con i substrati naturali L-DOPA e L-tirosina, mediante saggi spettrofotometrici. Questa attività era assente in cellule di insetto non infettate o esprimenti la tirosinasi umana in forma solubile. Quest’ultimo controllo ha confermato l’importanza della glicosilazione nel corretto folding della proteina. Un primo protocollo di purificazione della proteina in forma nativa risultato poco efficiente ha costretto ad effettuare una serie di miglioramenti non solo nel nella purificazione, ma anche nelle condizioni di espressione e nei test di attività adottati. Tuttavia il basso livello di espressione è rimasto il punto critico della proceduta, che ha obbligato a tentare di isolare l’enzima direttamente su gel SDSPAGE. Un sistema di test di attività, sviluppato utilizzando piastre da 96 pozzetti, ha permesso di determinare le costanti cinetiche di substrati naturali ed artificiali, cosi come di inibitori noti. Lo screening è stato condotto in parallelo utilizzando l’estratto solubile contenente la tirosinasi umana e l’enzima tirosinasi di S. Antibioticus un enzima con un elevato livello di omologia con la tirosinasi di S. castaneoglobusporus la cui struttura e stata recentemente determinata. Questo ha permesso di confrontare direttamente i dati ottenuti per le due tirosinasi e proporre un modello per la tirosinasi umana.