A combined computational and experimental approach to human osteocalcin and GPCR Family C Group 6 Member A

INTRODUZIONE. L'uso di modelli murini transgenici ha permesso la recente identificazione di una regolazione reciproca tra osso, metabolismo energetico e ormoni sessuali. L’osteocalcina, una proteina della matrice ossea che subisce delle modifiche post-traduzionali vitamina-K dipendenti ed è classicamente implicata nella regolazione delle dimensioni e la forma dei cristalli di idrossiapatite, sembra essere nella sua forma circolante un ormone e non un semplice marcatore di rimaneggiamento osseo. La somministrazione di osteocalcina nella sua forma sottocarbossilata regola l’espressione genica e proteica negli adipociti, nelle cellule β pancreatiche e del Leydig attraverso un recettore associato a una proteina G, il recettore GPRC6A, con una selettività genere-specifica. Sono stati condotti numerosi studi che hanno associato i livelli di osteocalcina circolante sia con parametri di controllo gluco-metabolico che con fattori di rischio cardiovascolare. La gran parte degli studi clinici, tuttavia, non ha considerato né l'influenza dei livelli di vitamina K né ha rilevato l’osteocalcina nelle varie forme di differente carbossilazione. È interessante sottolineare, infine, come il recettore GPRC6A sia responsabile della mediazione degli effetti non-genomici degli androgeni e, analogamente, il recettore putativo dell’SHBG sembra essere un recettore associato a una proteina G. OBIETTIVO dello STUDIO. Obiettivo dello studio è stato studiare in un approccio in due fasi, supportati dalle osservazioni cliniche, le possibili interazioni tra l’osteocalcina, SHBG e il recettore GPRC6A a livello computazionale e, successivamente, verificarle in un modello sperimentale cellulare in vitro. MATERIALI e METODI. I parametri clinici e di laboratorio sono stati studiati in una coorte di 91 pazienti, che includevano pazienti obesi e soggetti sani di controllo con un disegno trasversale. Un’analisi della struttura proteica tridimensionale e una di docking sono state elaborate con rispettivamente quattro (i.e. TM-align, FATCAT, TriangleMatch, TopMatch) e tre (i.e. GRAMM-X, ZDOCK, PatchDock) algoritmi bioinformatici. La piattaforma iClickMD-min script é stata utilizzata per l’analisi computazionale della struttura conformazionale dell’osteocalcina, ottenuta tramite il software MOE, in diverse forme di carbossilazione e in presenza o assenza di ioni calcio. Tali analisi sono state integrate con simulazioni di dinamica molecolare, i cui risultati sono stati successivamente confrontati con quelli ottenuti dalle analisi spettroscopiche. I risultati sono stati validati con studi di espressione genica e proteica e saggi di spiazzamento con tecniche di immunofluorescenza e citofluorimetria su colture di cellule HEK-293T. RISULTATI. Il nostro studio dimostra per la prima volta l'esistenza di una competizione per un sito di legame specifico tra l’osteocalcina e SHBG su cellule umane che esprimono il recettore GPRC6A. Un’analisi predittiva computazionale supporta i risultati, identificando nella sequenza amminoacidica compresa tra i residui residui Gly145 e Leu161 di SHBG l’interfaccia più probabile. I nostri esperimenti descrivono, inoltre, per la prima volta la struttura dell’osteocalcina umana nelle sue varie forme di carbossilazione. L'influenza del legame degli ioni calcio sulla struttura dell’osteocalcina sembra, tuttavia, essere più forte della presenza di un differente stato di carbossilazione. I nostri dati clinici mostrano, infine, uno squilibrio tra le differenti forme di osteocalcina nella coorte di soggetti obesi affetti da ipogonadismo. CONCLUSIONI. L’approccio utilizzato nel presente studio offre un modello di indagine mirata sull’uomo con il potenziale di poter identificare nuove vie di regolazione e svelare prospettive terapeutiche. Il supporto bioinformatico all’interpretazione degli esperimenti in vitro offre i fondamenti per la sintesi del peptide precedentemente descritto, le cui implicazioni biologiche potranno essere preliminarmente validate sullo stesso modello, al fine di indagare le basi della regolazione integrata tra tessuto osseo, metabolismo energetico e ormoni sessuali.