Development of novel super stealth immunoliposomes for anticancer drug delivery

Attualmente, i liposomi rivestono un ruolo importante nel campo del drug delivery per la loro biocompatibilità e versatilità. La modifica della superficie liposomiale con polimeri idrofilici, generalmente polietilenglicole (PEG), conferisce proprietà “stealth” consentendo di evitare la rapida eliminazione da parte del sistema reticoloendoteliale, aumentando così il tempo di emivita in vivo. In questo modo, è favorito l’accumulo passivo nel sito tumorale, sfruttando l’aumentata permeabilità vascolare e il ridotto drenaggio linfatico (effetto EPR [1]) tipici dei tessuti tumorali. Il presente lavoro è mirato alla formulazione di nuovi immunoliposomi super stealth (SSILs) dotati sia di maggiore stabilità nel circolo sanguigno sia di un targeting selettivo al sito tumorale. L’aumentata stabilità è stata ottenuta mediante l’uso di molecole di PEG dendrone coniugate a 2 o 4 molecole di distearoilfosfoetanolamina (DSPE) [2]. Questo ha consentito di aumentare le interazioni idrofobiche con il doppio strato fosfolipidico rispetto al classico derivato PEG-fosfolipide ed evitare il distacco del polimero durante il circolo ematico. Il targeting attivo, invece, è stato ottenuto mediante coniugazione di questi derivati PEG dendrone-lipidi ad un agente di targeting. In questo caso, il Fab’ (fragment, antigen-binding) del Trastuzumab che ha una elevata affinità verso il recettore HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2), sovraespresso sulla superficie di alcune cellule tumorali. La doxorubicina, agente antineoplastico comunemente utilizzato nel trattamento di una grande varietà di tumori (lucemie, linfomi, vari tipi di carcinoma e sarcomi), è stata scelta per essere incapsulata all’interno di questi nanocarriers. Dal momento che Doxyl®/Caelyx®, formulazione liposomiale stealth contenente doxorubicina presente in commercio, contiene mPEG2kDa-DSPE, è stato inizialmente deciso di formulare gli SSILs usando dei derivati PEG2kDa-dendrone-lipidi. Studi preliminari in vitro e in vivo effettuati su liposomi super stealth (SSLn, n=2 o 4 DSPE) contenenti il 5% o 10% mol di mPEG2kda-(DSPE)n e privi di agente di targeting, hanno evidenziato un trend negativo di stabilità all’aumentare dell’ancoraggio idrofobico (PEG-DSPE > PEG-DSPE2 > PEG-DSPE4). Questo comportamento è stato confermato dagli studi di farmacocinetica in vivo poiché i liposomi stealth (SL) presentavano un’emivita prolungata (t½ ~22h) rispetto ai liposomi super stealth (SSL2 t½ ~8h e SSL4 t½ ~7h), i quali venivano eliminati dal circolo sanguigno anche più rapidamente dei liposomi convenzionali (t½ ~10h). Per questo motivo è stato deciso di formulare gli immunoliposomi super stealth usando un polimero a maggior peso molecolare (PEG 5kDa). I derivati mPEG5kDa-(DSPE)n e Boc-NH-PEG5kDa-(DSPE)n sono stati sintetizzati, purificati e caratterizzati con successo mediante spettroscopia 1H NMR. La funzionalizzazione dei derivati H2N-PEG-lipidi con il cross-linker BMPS (estere N-(ß-maleimidopropilossi)succinimide) ha fornito rese migliori ottenendo i monoPEGhilati Fab’-PEG5kDa-DSPE, Fab’-PEG5kDa-(DSPE)2 and PEG5kDa-(DSPE)4, come dimostrato dalla caratterizzazione mediante SDS-PAGE. La post-insertion dei derivati mPEG-(DSPE)n e/o Fab’-PEG-(DSPE)n in liposomi convenzionali preformati contenenti il farmaco non è avvenuta con successo o ha portato all’aggregazione delle vescicole liposomiali. Le immagini acquisite mediante TEM hanno evidenziato superfici discontinue, motivando l’instabilità delle vescicole formulate. La post-insertion dei derivati Fab’-PEG dendrone-lipidi su liposomi stealth (SL) e super stealth (SSLn) preformati contenenti doxorubicina, per ottenere i corrispondenti immunoliposomi super stealth (SSILn), ha fornito formulazioni stabili ed omogenee di SSIL2 (102.11 ± 3.68 nm) e SIL (128.23 ± 1.02 nm) con basso indice di polidispersività (PdI <0.1). La post-insertion è risultata in 79.8 µg Fab’/µmol HSPC negli SIL e 23.63 µg Fab’/µmol HSPC negli SSIL2. La formulazione SSIL4 ha riportato problemi di aggregazione anche con quest’ultimo approccio di post-insertion. Studi di stabilità in vitro a lungo termine hanno evidenziato che le tutte le formulazioni testate erano stabili ed omogenee (PdI <0.1) dopo 2 mesi di incubazione a 4°C e 25°C, dimostrando l’effetto stabilizzante del PEG che previene l’aggregazione per ingombro sterico. Incubando a 37°C, invece, le formulazioni iniziavano ad aggregare dopo 14 giorni, mostrando anche un aumento della polidispersività (PdI >0.1). Studi di rilascio in vitro hanno confermato che tutte le formulazioni testate sono in grado di trattenere efficacemente la doxorubicina incapsulata, la quale non viene rilasciata durante le 16 ore di incubazione. Studi preliminari in vitro di citotossicità, eseguiti su cellule umane di carcinoma mammario (BT-474) che sovraesprimono HER-2, hanno dimostrato che SL-DXR non sono in grado di ridurre la vitalità cellulare al di sotto del 50% dopo un trattamento di 24 ore con DXR 10 µM, mentre risulta ridotta al 40% dopo trattamento con SIL-DXR e SSIL2-DXR nelle stesse condizioni sperimentali. Un calcolo preliminare dell’IC50 ha dimostrato che tutte le formulazioni liposomiali possiedono la stessa potenza nell’indurre la morte cellulare, mentre minime differenze sono state osservate prendendo in considerazione l’efficacia di ciascuna formulazione (SL-DXR < SIL-DXR < SSIL2-DXR). È interessante notare che SSIL2-DXR dimostrano la stessa efficacia della DXR libera. Studi di farmacocinetica in vivo hanno evidenziato la prolungata emivita di SSIL2 (t½ = 37.80 h), confermando l’effetto stabilizzante dei derivati PEG dendrone-lipidi rispetto a mPEG-DSPE. Di conseguenza, una riduzione della clearance plasmatica di SSIL2 (~0.2 ml/h) è stata osservata rispetto a SL (~0.5 ml/h), con aumento della biodisponibilità (AUC) e del volume di biodistribuzione (Vd) rispetto alle altre formulazioni testate. La valutazione della tossicità d’organo in vivo dopo una singola somministrazione di 2.5 mg/kg in DXR ha messo in evidenza che l’espressione genica delle tre citochine proinfiammatorie interleukina β1 (IL-1β), interleukina 6 (IL-6) e tumor necrosis factor α (TNFα) è aumentata nei ratti trattati con SL-DXR e SIL-DXR, specialmente nel fegato, nella milza e nel cuore. L’analisi istologica effettuata su sezioni di tessuto di fegato e milza di ratti trattati con SL-DXR e SIL-DXR ha dimostrato la presenza di notevoli alterazioni patologiche (lesioni granulomatose, corpi apoptotici, ecc), mentre gli organi dei ratti trattati con DXR e SSIL2-DXR sono risultati complessivamente sani. Nel cuore, nei polmoni e nel cervello non è stata evidenziata alcuna alterazione patologica in tutti i gruppi di animali esaminati. In generale, SSIL2 sono emersi come la formulazione migliore e più sicura in termini di profilo farmacocinetico, espressione di citochine infiammatorie e analisi istologica degli organi del sistema reticolo endoteliale (RES), rappresentando perciò un promettente sistema per migliorare il veicolamento di farmaci antitumorali convenzionali.