Analisi quantitativa delle dimetilarginine (ADMA ed SDMA) e degli aminoacidi strutturalmente correlati mediante UPLC-ESI-MS/MS nella diagnosi e prognosi di patologie NO-dipendenti correlate allo stress ossidativo nell' adulto e nel bambino.

Presupposti: L' ADMA, dimetilarginina asimmetrica, è un analogo metilato dell'aminoacido arginina. Essa viene prodotta all'interno delle cellule attraverso processi di metilazione di catene polipeptidiche e rilasciata in circolo dopo proteolisi. L'ADMA compete con l'arginina, precursore necessario per la sintesi dell'ossido nitrico, per il legame con l'enzima ossido nitrico sintetasi (NOS), inibendone così la sintesi. Lâ NO è il più potente vasodilatatore conosciuto, che svolge un ruolo chiave, agendo sul sistema endoteliale, nel mantenimento di una grande varietà  di meccanismi omeostatici del nostro organismo. E' noto da tempo che l'ADMA, per inibizione della produzione di NO, è coinvolta nella patogenesi delle principali disfunzioni indotte da stress ossidativo NO-dipendente a livello cardiovascolare, renale e recentemente anche nell'ambito delle malattie respiratorie come l'asma e la fibrosi cistica, in quanto contribuisce ad aggravare lo stato infiammatorio e l'iperreattività  delle vie aeree. Analizzando i dati riportati in letteratura, si è notato che non vi sono studi longitudinali sulle concentrazioni di ADMA in età neonatale, sia nei soggetti a termine che in quelli prematuri, né sono stati ad oggi dosati i livelli di ADMA nel condensato dell'aria espirata, che si ritiene essere un biofluido la cui composizione riflette quella del liquido di superficie delle vie aeree, oltre ad essere caratterizzato dalla non invasività  e la semplicità  nell'esecuzione della metodica di prelievo. Scopo dello studio: il presente lavoro ha avuto in primo luogo lo scopo di applicare il metodo UPLC-ESI-MS/MS messo a punto nel nostro laboratorio, su una popolazione di adulti sani al fine di verificare la validità  della metodica, confermando i dati esistenti in letteratura. Si è poi passati all'applicazione su soggetti adulti affetti da diverse patologie (iperglicemia, cardiopatie, preeclampsia) per verificarne l'applicabilità  in ambito clinico, ed infine è stata presa in considerazione la popolazione pediatrica, determinando in maniera longitudinale la concentrazione sierica di ADMA e delle altre arginine metilate (SDMA, NMMA) in un gruppo di neonati a termine in prima e terza giornata di vita e in un gruppo di neonati pretermine di peso neonatale estremamente basso (< 1000 g - ELBW) durante il primo mese di vita. Per quanto riguarda lo studio delle malattie respiratorie lo scopo è stato quello di valutare se l'ADMA è dosabile nel condensato dell'aria espirata in bambini affetti da asma in buon controllo, con o senza terapia, confrontati con un gruppo di bambini sani e verificare la riproducibilità della metodica di analisi dell'ADMA sull'EBC. Materiali e metodi: La determinazione quantitativa è stata effettuata attraverso una separazione cromatografica in UPLC e analisi dei campioni mediante uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Le caratteristiche del metodo sono costituite dall'utilizzo di quantità  esigue di campione, elevata specificità  e sensibilità  strumentale. Per poter ricavare i valori di riferimento della popolazione adulta sono stati arruolati 36 soggetti sani (18 uomini e 18 donne di età  media pari a 36.5 anni) come gruppo di controllo rispetto a pazienti con infarto miocardico (20 soggetti di cui 10 uomini e 10 donne di età  media pari a 75.5 anni) e diabete di tipo II insulino resistente (30 soggetti di cui 16 uomini e 14 donne di età  media pari a 71 anni). Lo studio sulle donne in gravidanza ha previsto l'arruolamento di 15 donne affette da pre-eclampsia confrontate con 15 donne in gravidanza normale (età  media 32 anni per entrambi i gruppi). L'applicazione in ambito pediatrico ha infine coinvolto un gruppo di 31 neonati di peso estremamente basso alla nascita (ELBW <1000 grammi) rispetto al gruppo di controllo di 30 neonati sani a termine, e un gruppo di 29 bambini asmatici di età compresa tra 5,8 e 16,3 anni confrontati con i relativi controlli sani (62 bambini di età  compresa tra 5,1 e 15,4 anni), di cui è stato raccolto il condensato dell'aria espirata. Risultati: I valori dei diversi metaboliti ottenuti sui soggetti adulti sani hanno confermato i dati riportati in letteratura, mentre nei soggetti cardiopatici le concentrazioni di ADMA ed SDMA sono state rispettivamente pari a 0.89±0.17µM e 0.72±0.26µM , risultando entrambi significativamente più alti rispetto ai controlli sani (p<0.05), a differenza invece dei soggetti iperglicemici che hanno mostrato livelli significativamente inferiori (p=0.002) di ADMA (0.47±0.13µM) rispetto ai relativi controlli, ma nessuna differenza nelle concentrazioni di SDMA. Il confronto tra donne gravide sane e con pre-eclampsia, ha invece evidenziato che la concentrazione di ADMA al momento del ricovero è stata significativamente più bassa nelle gravide ipertese rispetto alle gravide normotese (p=0.006), contrariamente a quanto riportato in letteratura, mentre a 30 giorni di distanza dal parto la situazione si è invertita. Nel gruppo dei neonati a termine, l'ADMA in prima giornata è risultata estremamente elevata, all'incirca 2-3 volte maggiore rispetto agli adulti. La sua concentrazione è diminuita rapidamente, riducendosi già  del 25% in terza giornata di vita. Nei soggetti pretermine di peso estremamente basso il dosaggio di ADMA è risultato sensibilmente più basso rispetto ai neonati a termine senza variazioni nel tempo. Considerando insieme i due gruppi di neonati, è presente una correlazione significativa tra valori di ADMA in prima ed in terza giornata e l'età  gestazionale, nonché il peso neonatale. Lo studio condotto sull'EBC ha, infine dimostrato che è possibile misurare l'ADMA nel condensato con una buona riproducibilità  intrasoggetto a distanza di 24 ore. I valori di ADMA nei bambini asmatici (mediana 2,17 [1,15-3,19] µmol/mL) sono risultati significativamente più elevati rispetto a quelli dei bambini sani (mediana 1,1 [0,7-1,5] µmol/mL, p<0,001) evidenziando anche una significativa correlazione dei livelli di questo metabolita con il dosaggio dei farmaci corticosteroidei inalatori ICS (p=0,005; r=0,406) assunti dai soggetti asmatici. Conclusioni: Il metodo sviluppato in questo studio soddisfa i requisiti analitici di precisione, riproducibilità , specificità , sensibilità  e recupero analitico indispensabili per l'impiego in ambito clinico. Esso inoltre può essere facilmente automatizzabile e adatto per il suo impiego su larga scala consentendo l'applicazione in qualità  di metodo diagnostico nell'ambito delle patologie da stress ossidativo e disfunzione endoteliale e delle malattie cardiovascolari. L'uso di una quantità  esigua di campione, inoltre ne suggerisce l'impiego per lo studio delle diverse patologie del neonato come la sepsi, l'ipertensione polmonare e lo scompenso cardiaco. Infine, essendo questo il primo studio che dimostra la fattibilità  del dosaggio dell'ADMA e dei biomarker di stress ossidativo nel condensato dell'aria espirata, ottenendo risultati concordanti con lavori precedenti che dimostravano un aumento di ADMA nell'asma in altre matrici biologiche, ci sono i presupposti per estendere la casistica per confermare il suo possibile ruolo come biomarker nell'infiammazione asmatica e come possibile target di nuovi approcci farmacologici.