Caratterizzazione e plasticità differenziativa di popolazioni cellulari staminali isolate da sangue periferico

Le cellule staminali sono cellule primitive indifferenziate, dotate di capacità proliferativa illimitata e in grado di differenziare in cellule specializzate in presenza di stimoli specifici. Nell’ultimo decennio, grande interesse è stato rivolto all’impiego in campo medico di cellule staminali adulte che, rispetto alle cellule staminali embrionali totipotenti, non comportano la distruzione dell’embrione per il loro ottenimento e pertanto non sollevano alcun problema di carattere etico. Le cellule staminali adulte sono cellule prevalentemente multipotenti, identificate in nicchie a livello del tessuto adiposo, del midollo osseo e della cute di individui adulti e bambini. Studi sperimentali hanno evidenziato che nel sangue periferico animale e umano sono presenti cellule ad alta capacità plastica e che dunque potrebbero essere utilizzate in clinica per lo sviluppo di programmi di terapia cellulare ed il recupero di danni tessutali refrattari alle terapie mediche classiche. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno dimostrato di essere idonee all’impiego in vivo per lo sviluppo di programmi di terapia cellulare. È stato inoltre dimostrato che, in definite condizioni di coltura, le cellule MSC possono acquisire un fenotipo simil-cardiomiocitario. La strategia più comune utilizzata per indurre il loro differenziamento cardiomiogenico in vitro è il trattamento per 24 ore con la 5-azacitidina (5-AZA), un agente chimico demetilante del DNA. Dopo induzione, le cellule mostrano una morfologia miotubulare, caratterizzata dalla presenza di unità sarcomeriche, un nucleo centrale e tipici granuli atriali. Similmente ai cardiomiociti fetali ventricolari, esse esprimono proteine contrattili, quali l’α-actina, la catena pesante (MHC) e leggera della miosina (MLC). Nel corso degli ultimi dieci anni, lo sviluppo dell’ingegneria tessutale delle valvole cardiache ha aperto un nuovo orizzonte verso l’utilizzo di un costrutto biocompatibile in grado di essere rimodellato dopo l’impianto. Numerosi studi hanno messo in luce l’efficacia delle matrici naturali acellulari per il recupero di danni tessutali a livello muscolare, osseo e tracheale. I metodi sperimentati per la decellularizzazione di valvole aortiche e polmonari hanno previsto l’uso di detergenti quali il sodio dodecilsolfato (SDS), il sodio deossicolato (SD), il sodio colato (SC), il Triton X–100 (TX) e l’enzima tripsina. Il trattamento TRICOL, che comprende l’uso di TX, sodio colato (SC), soluzioni ipo- ed iper-toniche e Benzonase, è stato sviluppato da Spina e collaboratori per la preparazione di valvole porcine aortiche e polmonari. L’ingegnerizzazione della matrice con cellule autologhe isolate da sangue periferico potrebbe ottimizzare l’attecchimento dell’impianto e consentire il suo mantenimento in sede fino a completa integrazione. Lo scopo della tesi è stato isolare cellule circolanti multipotenti da sangue periferico, idonee ad applicazioni di ingegneria tessutale. Lo studio è stato eseguito utilizzando il modello animale minipig. Sono state isolate popolazioni fibroblastoidi mediante la tecnica di adesione alla plastica, aventi fenotipo CD44high, CD106+, CD90low, SLA-DRlow, CD45-, CD34-, CXCR4- (CSP). L’espansione a lungo termine, eseguita per 39 passaggi, ha dimostrato che le popolazioni CSP sono altamente stabili da un punto di vista fenotipico e morfologico, come dimostrato mediante analisi citometrica e di microscopia ottica su subcolture intermedie VIII, XXIV e XXXIX. Inoltre, la specifica induzione con terreni differenziativi in senso adipogenico, osteogenico e cardiomiogenico ha dimostrato che le cellule CSP sono cellule plastiche, che rispondono agli stimoli in modo specifico accumulando trigliceridi, producendo matrice extracellulare mineralizzata ed esprimendo marcatori cardiomiogenici quali il fosfolambano, l’alfa-actina muscolo specifica e la troponina cardiaca T. Allo scopo di valutare le potenzialità di impiego in campo cardiologico di popolazioni circolanti con immunofenotipo CD44high, CD106+, CD90low, SLA-DRlow, CD45-, CD34-, CXCR4-, è stata oggetto di studio la crescita delle cellule CSP su matrici valvolari decellularizzate (VD) aortiche e polmonari. La valutazione dell’adesione è stata eseguita mediante analisi SEM a differenti intervalli di tempo (7, 14, 28, 35 e 42 giorni). Lo studio morfologico mediante analisi SEM ha dimostrato la colonizzazione della superficie di semina da parte delle cellule CSP e la loro organizzazione in monostrati continui. Lo studio istologico mediante immunofluorescenza ha evidenziato sui campioni la presenza di elastina e di collagene (IV e I) mentre lo studio immunoistochimico ha dimostrato la positività delle cellule per l’alfa-actina cellulare scheletrica.