Molecular Approaches for the Individuation and Characterization of Technological and Quality Traits in Microorganisms of enological interest

Il genere Saccharomyces include microrganismi importanti per molti processi tecnologici, in particolare nell’industria alimentare e delle fermentazioni. In campo enologico, i ceppi di lievito generalmente utilizzati per la fermentazione del vino (appartenenti al gruppo dei Saccharomyces sensu stricto) sono stati selezionati nel tempo a partire da fermentazioni spontanee e sono ceppi specificamente adattati alle condizioni di cantina. Alcune caratteristiche essenziali, che sono alla base dei criteri per la loro stessa selezione, sono la capacità di trasformare efficientemente i carboidrati in alcol attraverso la fermentazione ed una notevole resistenza all’etanolo. I lieviti appartenenti al gruppo dei S. sensu stricto sono in grado di crescere in mosto d’uva, dove il livello di zuccheri è molto alto, il pH basso, azoto, lipidi e vitamine sono presenti in scarse quantità e spesso vengono aggiunti solfiti prima sella fermentazione. Nei programmi che prevedono la selezione di lieviti da utilizzare in ambiente enologico, nelle prime fasi sperimentali, vengono raccolti centinaia di isolati naturali che sono poi sottoposti a caratterizzazione con lo scopo di evidenziare quelli che posseggono importati caratteristiche tecnologiche. Nella maggior parte dei casi, ciò significa selezionare solo ceppi appartenenti alla categoria tassonomica Saccharomyces sensu stricto. Per questo motivo è estremamente utile disporre di un test genetico che permetta di distinguere rapidamente e in modo inequivocabile lieviti di potenziale interesse tecnologico. Nella prima parte di questo lavoro è stata verificata la possibilità di utilizzare l’analisi della regione ITS, contenuta nel DNA ribosomale, come metodo per determinare l’identità di isolati naturali. Dopo aver costruito un raccolta dei profili elettroforetici dei principali lieviti enologici, sono stati sottoposti ad identificazione, mediante confronto, 350 isolati naturali provenienti da vinacce di Moscato e Prosecco destinate alla produzione della Grappa. Questo metodo, ampiamente utilizzato in letteratura, richiede l’impiego di tempo per l’esecuzione che male si adatta alle già citate esigenze di un programma di selezione. Per questo motivo è stata proposta una nuova metodica la cui messa a punto ha previsto la produzione di una coppia di primers per amplificazione PCR, disegnata all’interno della regione variabile D1/D2 della subunità 26S dell’RNA ribosomiale del lievito, con la quale si ottiene un frammento di DNA specifico per le sette specie appartenenti al gruppo Saccharomyces sensu stricto, mentre non si osserva nessuna amplificazione nei ceppi Saccharomyces sensu lato né in altre 18 specie tra le più diffuse in ambiente enologico, saggiate come controlli. E’ stata inoltre disegnata una seconda coppia di primers, nella regione di DNA codificante l’rRNA 18S, composta di sequenze perfettamente conservate nelle 42 specie di lieviti enologici esaminate: questa coppia genera un amplificato di circa 900 pb comune per tutti i ceppi ed è stata usata come controllo positivo di reazione per la messa a punto di un protocollo di multiplex PCR. Il nuovo metodo proposto, insieme all’analisi ITS, permette di ottenere una “caratterizzazione su basi genetiche” dei ceppi enologici che sicuramente è richiesta per affrontare, in una fase successive, la “caratterizzazione tecnologica” che ha lo scopo di valutare le proprietà enologiche possedute dai singoli ceppi. La tecnologia DNA-microarray che è ormai diventata uno strumento di riferimento per una analisi simultanea dell’intera espressione genica di un individuo, può essere utilizzata per valutare le differenze presenti tra ceppi enologici nell’espressione di caratteri tecnologici e di qualità. Per questo scopo, la seconda parte del lavoro sperimentale, ha riguardato l’investigazione, proprio mediante la tecnologia DNA-microarray, dei cambiamenti a livello trascrizionale che si verificano in due ceppi commerciali di lievito durante la vinificazione condotta in condizioni di laboratorio e su scala pilota in cantina. Sono stati scelti due lieviti comunemente utilizzati in enologia (71B e EC1118, Lallemand), analizzati e confrontati durante fermentazioni in volumi di 1 litro e 100 litri utilizzando mosto naturale bianco. Questi ceppi hanno attitudini e caratteristiche enologiche differenti: 71B è noto per essere un forte produttore di aromi fermentativi mentre EC1118 è dotato di notevole vigore fermentativo ma è più neutro dal punto di vista aromatico. Dal confronto dei due ceppi è emersa una sostanziale differenza nella regolazione della via metabolica di produzione degli aminoacidi solforati (maggiormente attiva nel ceppo 71B), come anche del gene responsabile per l’efflusso dei solfiti (SSU1). Inoltre è stato osservato che i geni coinvolti nella produzione di aromi secondari (esteri ed alcoli superiori) mostrano una sensibile differenza di espressione, seppur meno marcata che nei casi precedenti. Tutti i risultati ottenuti sono stati confermati tramite analisi in Real-time PCR, tecnica molecolari di ultima generazione ampiamente utilizzata per lo studio dell’espressione genica. Confrontando i due volumi impiegati per le vinificazione, i geni sovra-espressi sono risultati essere legati alla risposta allo stress, in particolare alle differenti condizioni di anaerobiosi che si sono verificate a causa delle dimensioni diverse delle masse da vinificare. Questa situazione ha prodotto minime difformità nelle condizioni di fermentazione che sono state percepite dal lievito. I risultati ottenuti permettono di affermare che questo lavoro ha contribuito ad aumentare la comprensione delle basi genetiche che determinano le differenti caratteristiche di fermentazione associate ai lieviti enologici e a definire il livello di riproducibilità delle loro performance in condizioni di laboratorio e di cantina.