Functional interactions of the Tax and p13 proteins of Human T-cell Leukemia Virus Type I

Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) stabilisce un'infezione persistente negli uomini. Circa il 3% degli individui infettati sviluppa la leucemia/linfoma a cellule T dell'adulto (ATLL), un'aggressiva neoplasia a carico dei linfociti T CD4+ maturi. L'attivazione della via di segnale di NF-κB mediata dalla proteina virale Tax è un evento cruciale nella patogenesi dell’infezione da HTLV-1. Tax attiva entrambe le vie di segnale di NF-κB, canonica e non-canonica, promuovendo la traslocazione nucleare di NF-κB e la trascrizione di geni che favoriscono la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule T. I nostri studi precedenti hanno rivelato che la proteina virale p13 favorisce la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) a livello mitocondriale, causando l'attivazione di cellule T normali. I ROS possono essere paragonati ad un reostato che controlla l'attività di diverse vie di trasduzione del segnale, inclusa la via di NF-κB. Lo scopo primario di questa tesi è stato quindi di verificare l'ipotesi che Tax e p13 potessero attivare sinergicamente la via di trasduzione del segnale di NF-κB in cellule T normali. A tal fine, è stato ottimizzato un protocollo di trasfezione di cellule T primarie utilizzando un approccio innovativo basato sull'elettroporazione di RNA trascritto in vitro. L'attivazione della via di NF-κB è stata analizzata misurando l'espressione dei geni target di NF-κB CD25, mediante analisi citofluorimetrica, e 4-1BB, mediante RT-PCR quantitativa. I risultati ottenuti hanno mostrato che in cellule T normali, la co-trasfezione di Tax e p13 causa l'attivazione sinergica della via di NF-κB misurata come incremento dei livelli di espressione di entrambi i geni target. Oltre ad essere un target trascrizionale di NF-κB, il CD25 è anche un marcatore precoce di attivazione di cellule T. Per verificare il possibile effetto di Tax e p13 sull'attivazione cellulare, abbiamo misurato mediante analisi citofluorimetrica l'espressione del CD38, un marcatore intermedio-tardivo di attivazione. La linea T-cellulare leucemica Jurkat, caratterizzata da un fenotipo costitutivamente CD38 positivo, è stata utilizzata come controllo. I risultati di questa analisi hanno confermato la sinergia di Tax e p13, nonostante l'effetto sull’espressione del CD38 non fosse così prominente come quello osservato per il CD25, suggerendo che, nel nostro contesto sperimentale, Tax e p13 spingano le cellule T in uno stadio precoce-intermedio di attivazione. In complesso questi risultati suggeriscono che, in contrasto con il ruolo ben stabilito di Tax nell'attivazione della via di NF-κB in linee cellulari tumorali, nel contesto delle cellule T normali, l'induzione dei geni target di NF-κB necessita l'azione sinergica di Tax e p13. Gli studi attualmente in corso sono volti a verificare la ROS-dipendenza dell'effetto sinergico di Tax e p13 sulla via di segnale di NF-κB. Inoltre, verificheremo la validità dell'interazione funzionale di Tax e p13 nel contesto del intero genoma di HTLV-1. A tal fine, paragoneremo l'attivazione della via di NF-κB indotta da un clone molecolare di HTLV-1 wild type, con quella indotta da un clone molecolare di HTLV-1 p13-knock-out. Questi esperimenti verranno condotti in cellule T primarie ed in cellule dendritiche, che rappresentano il principale target infezione da HTLV-1 in vivo.