Pediatric AML: from prognostic biomarkers to functional characterization

La leucemia acuta mieloide (LAM) è una malattia geneticamente eterogenea,caratterizzata da ricorrenti anomalie molecolari. Nonostante la prognosi dei pazienti pediatrici affetti da LAM sia notevolmente migliorata negli ultimi anni, il tasso di ripresa di malattia è di circa il 30% 1–3. Numerosi studi sono emersi per identificare nuove anomalie genetiche o vie di segnale deregolate nella LAM pediatrica al fine di migliorare la stratificazione dei pazienti nelle diverse classi di rischio, e di conseguenza poter adottare dei percorsi terapeutici specifici e più mirati. Ad oggi tuttavia, per circa il 50% dei casi non si trova alla diagnosi un marcatore molecolare noto in grado di garantire una corretta stratificazione del paziente. Per tale ragione il mio dottorato di ricerca ha avuto come primo scopo la ricerca e l’identificazione di nuovi marcatori molecolari alla diagnosi , e di studiarne il ruolo prognostico affinché si possa garantire una più corretta diagnosi a un più alto numero di pazienti, e si possa valutarne in caso un ruolo anche come marker di monitoraggi durante la terapia del paziente. Infine, allo scopo puramente diagnostico, è stato abbinato uno scopo di ricerca di base, cioè caratterizzare il processo neoplastico mediato da alcuni di questi marcatori molecolari, cercando di identificare dei geni malattia che possano servire essere dei candidati target terapeutici, utili a porre le basi per una gestione sempre più personalizzata e quindi efficace della terapia. Inizialmente ho effettuato una serie di screening molecolari con l’intento di valutare l'incidenza di alcune anomalie genetiche precedentemente conosciute solo tramite case report o identificate tramite sequenziamento massivo dell’RNA. In particolare, ho definito la del(4)(q12)FIP1L1-PDGFRA, la t(16;21)(p11;q22)FUS-ERG, la t(8;16)(p11;p13)MOZ-CBP, la t(11;17)(q23;q12-21)MLL-AF17, t(4;11)(q35;q23)MLL-ARGB2, la t(3;5)(q25;q34)NPM1-MLF1, il MLLPTD, e la t(11;17)(p15.5;p13)NUP98-PHF23 come eventi mutazionali rari nella coorte pediatrica italiana arruolata nel protocollo LAM 2001-02 (totale pazienti N=482). Al contrario, la t(5;11)(q35;p15.5)NUP98-NSD1 è stata riscontrata avvenire con una frequenza del 4%, e spesso in concomitanza alla mutazione FLT3-ITD (nel 50% dei casi). Tale traslocazione è stata inoltre valutata per il suo peso prognostico, rivelandosi un fattore prognostico negativo perché associato ad un elevato rischio di recidiva e morte. Poi, un altro screening ha riguardato la valutazione delle presenza di mutazioni a carico del gene c-KIT, in un gruppo di pazienti già con riarrangiamento del CBF. Le mutazioni di questo recettore delle tirosin chinasi sono già state ampiamente descritte in numerosi studi soprattutto riguardanti pazienti adulti affetti da LAM4. I risultati confermano un’alta frequenza di mutazione di c-KIT anche nei pazienti pediatrici con t(8;21)RUNX1-RUNX1T1 (25%) e con inv(16)CBFB-MYH11 ( 18.5%). Il valore prognostico negativo è risultato significativo solo nel gruppo con RUNX1-RUNX1T1, per i quali, l’identificazione di queste mutazioni potrebbero supportare l’uso di eventuali terapie con inibitori delle tirosin chinasi per migliorare la loro cura. Oltre alla diagnosi, il marcatore molecolare può avere un ruolo fondamentale anche durante il corso della malattia. Mi sono occupata di mettere a punto lo studio della malattia residua minima (MRM) mediante PCR quantitativa per tre importanti marker ricorrenti nelle LAM pediatriche. Ad oggi, il monitoraggio della MRM nella LAM pediatrica è scarsamente utilizzato. Qui, si propone il monitoraggio della MRM tramite la RQ-PCR dopo chemioterapia di induzione nei pazienti con t(8;21) e FLT3-ITD in grado di individuare i pazienti a più alto rischio di recidivare. Aver identificato la t(8;21) e FLT3-ITD come buoni marcatori molecolari per il monitoraggi della MRM, consentirà ai clinici di poter valutare delle strategie alternative in quei pazienti che potrebbero beneficiare di terapie farmacologiche supplementari al fine di evitare la ripresa della malattia. Infine, molto tempo del mio dottorato è stato impegnato alla caratterizzazione biologica e funzionale di alcuni marcatori molecolari ricorrenti con il fine ultimo di identificare nuovi possibili target terapeutici per migliorare la cure e la sopravvivenza dei pazienti. In primis, ipotizzando che la diversa risposta terapeutica dei casi FLT3-ITD abbia origine da una diversità biologia, abbiamo effettuato delle analisi di espressione genica su questo gruppo di pazienti. Questo studio ha permesso di identificare un profilo di espressione genica caratteristico per i pazienti che riducendo meno la malattia dopo l’induzione vanno incontro a un più alto rischio di ricadere. I processi biologici arricchiti in questi pazienti sono risultati riguardare la metilazione e l’acetilazione degli istoni, suggerendo che eventuali agenti deacentilanti o demetilanti, in combinazione con la terapia convenzionale, possano migliorare la sopravvivenza libera da avventi avversi di questi pazienti. Un altro studio funzionale ha preso in esame la t(6;11)(q27;q23)MLL-AF6. Circa il 10% della popolazione pediatrica italiana presenta uno dei riarrangiamenti a carico del gene MLL , tra questi la t(6;11) presenta la prognosi peggiore5,6. Attraverso studi in vitro, ho rivelato che la proteina AF6 endogena si localizza nel citoplasma insieme all’oncogene RAS in cellule di midollo osseo sano. Viceversa, nei pazienti con traslocazione t(6;11), AF6 è stato riscontrato essere nel nucleo impedendo il fisiologico controllo di RAS nel citoplasma, comportandone un’iper-attivazione della via. Sia il silenziamento di AF6 sia il trattamento con inibitori di RAS hanno confermato il ruolo chiave del pathway di RAS nel sostenere l’aggressività di questa leucemia. Infine, lo studio ha comprovato il Tipifarnib, farmaco già in uso nelle RASopatie7, come nuovo farmaco utilizzabile nei pazienti pediatrici con t(6;11). Il terzo studio funzionale ha riguardato un gene molto nuovo nella LAM pediatrica, il gene NUP98. Le traslocazioni somatiche associate a questo gene8–10 si sono riscontrate non rare nella corte pediatrica LAM italiana (4.6%). Lo studio più funzionale ha poi chiarito che ciascuna di queste traslocazioni identificate una diversa biologia così come un diverso ruolo prognostico . Grazie all’analisi di espressione genica ho identificato l’instabilità genetica come il processo biologico maggiormente deregolato in questo gruppo di pazienti con NUP98-LAM. Tale processo è stato verificato in vitro grazie a colture cellulari primarie di pazienti NUP98-NSD1 riarrangiati. Inoltre, ho dimostrato che il fattore di trascrizione CREB controlla la trascrizione del gene NUP98, cosi come di tutte le oncoproteine che si riscontrano nelle LAM mantenere l’N terminale dello stesso. Questi risultati identificano il ruolo funzionale della chimera NUP98-NSD1, e candidano CREB a possibile bersaglio terapeutico per combattere l’espressione della chimera e quindi la progressione della malattia . In conclusione, durante i tre anni di dottorato di ricerca ho caratterizzato una serie di marcatori molecolari che hanno permesso una migliore e più dettagliata stratificazione dei pazienti alla diagnosi. Dato il valore prognostico dei vari marcatori, essi sono stati inclusi nel nuovo protocollo terapeutico LAM 2013, che conferisce alla genetica molecolare un ruolo determinante nel guidare la terapia. Infine gli studi funzionali hanno finora portato all‘identificazione di nuovi target specifici in vari sottogruppi di LAM a prognosi infausta. Studi futuri sono in corso per valutare questi biomarcatori come target terapeutici da utilizzare per incrementare le possibilità di curare i bambini affetti da LAM .