LA RISPOSTA ALLO STRESS DA FREDDO IN Beta vulgaris STUDIO DELLA MODULAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA

Il lavoro di tesi è stato svolto presso il Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura - Centro di Ricerca per le Colture Industriali (C.R.A.-C.I.N., Bologna), impegnato da diversi anni in attività  di ricerca per il miglioramento genetico di barbabietola da zucchero per l'ottenimento di genotipi resistenti agli stress osmotici, quali lo stress idrico e il freddo. Nell' ambito dei progetti "Agronanotecnologie" e "Agronanotecnologie II" è stato possibile affiancare al miglioramento genetico classico, nuove tecnologie molecolari , le biotecnologie. Ai fini del miglioramento genetico per l'aumento dell'adattabilità  all'ambiente mediterraneo, abbiamo studiato la risposta allo stress da freddo in varietà  commerciali (sia a semina precoce primaverile sia a semina autunnale) di Beta vulgaris, da un punto di vista molecolare, fisiologico e metabolico, con una particolare attenzione alle vie metaboliche che controllano la sintesi di saccarosio e la sua ripartizione fra gli organi della pianta. L'approccio "dry/wet", ovvero l'integrazione di analisi sperimentali "high-throughput" del trascrittoma che consentono di ottenere una elevata quantità  di dati in tempi ridotti e di analisi bioinformatiche, rappresenta oggi la strategia di eccellenza per investigare la risposta molecolare della specie di interesse. Lo scopo principale è stato quello di comprendere i meccanismi molecolari alla base della risposta alle basse temperature sia tramite un'analisi della modulazione dell'espressione genica di specifici geni target legati al carattere di maggior interesse in questa specie, ovvero la qualità  e la resa in saccarosio (CSY, Corrected Sucrose Yield), sia tramite analisi ad ampio spettro mediante la tecnica cDNA-AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), per identificare sequenze la cui espressione risulti modulata dalle basse temperature. Questo lavoro ha permesso di individuare nuove sequenze reponsive al freddo, e di studiare le differenze comportamentali, da un punto di vista molecolare e fisiologico, tra varietà  selezionate per areali climatici differenti. L'attività  di ricerca svolta può essere riassunta nelle seguenti fasi: 1. Un'indagine preliminare sulla cv. Bianca e sulla cv. Franca ha permesso di verificare la diversa tolleranza al freddo delle due varietà , stabilendo, sulla base sperimentale, la temperatura di trattamento ideale, ovvero tale da garantire che lo stress venga percepito dalla pianta ma che non risulti letale, in modo tale da consentire le successive analisi di espressione. 2. Prima di determinare le variazioni dei livelli di trascritti tramite PCR quantitativa relativa, è stata condotta una selezione dei "geni di riferimento", denominati comunemente reference o housekeeping, necessaria per una normalizzazione accurata e precisa dei dati; ed è stato inoltre dimostrato che la normalizzazione su reference inappropriati risulta in una quantificazione errata. La valutazione di 7 geni comunemente impiegati come reference in altre specie, condizioni sperimentali e organi, ha permesso di identificare l'rRNA 18S e la tubulina come i migliori per analisi di espressione relativa condotte tra organi diversi messi a confronto (foglia, redice e cotiledone) e l'rRNA 5S e la tubulina per analisi su foglia di plantule trattate vs. controllo; allo stesso modo, è stato individuato l'elongation factor 1 α (EF1α) come migliore reference in radice. 3. Dopo aver valutato il livello dei trascritti realtivi a due geni noti per "rispondere" a livello di espressione a stress di tipo osmotico (DREB2A e colina mono-ossigenasi), le indagini successive hanno riguardato la modulazione dell'espressione di 10 geni di interesse correlati al metabolismo degli zuccheri. I riusltati evidenziano una risposta scalare nel tempo e differenziale nelle due cultivar prese in esame, e suggeriscono la fruttosio 1,6 bifosfatasi citosolica come nodo regolativo, almeno a livello di espressione, delle differenti riposte delle due cultivar. E' infatti possibile che ad una migliore performance dopo l'esposizione alle basse temperature sia legata la capacità  di convogliare il flusso dei carboidrati verso il metabolismo energetico piuttosto che verso l'accumulo in saccarosio. 4. L'analisi di espressione organo-specifica dei geni oggetto di studio in foglia e/o in radice è stata inoltre valutata, indicando che la maggior parte di essi ha un'espressione differenziale in uno dei due organi. 5. E' stata realizzata una libreria di sequenze di Beta vulgaris ottenuta, tramite cDNA-AFLP, dalle sequenze modulate dall'esposizione alle basse temperature di plantule di bietola in coltura idroponica (0°C e -2°C) in diversi organi (foglia e radice). 257 sequenze TDFs (Transcript- Derived Fragments) uniche (unigenes), putativamente coinvolte nella risposta alle basse temperature, sono state identificate e, attraverso una ricerca per similarità  di sequenza, caratterizzate da un punto di vista funzionale. La suddivisione in categorie funzionali ha consentito di stimare quali fossero i processi biologici e molecolari più coinvolti in tale risposta sia in foglia sia in radice. Il 47% delle sequenze risultano comunque sconosciute, in quanto non trova alcuna similarità  in banca dati, o trova similarità  con sequenze codificanti proteine a funzione non nota. 6. Al fine di verificare un'eventuale corrispondenza tra la modulazione dei geni analizzati e variazioni nel contenuto in metaboliti, un'analisi del profilo metabolico dei carboidrati è stato condotto tramite HPLC-ELSD (High Performance Liquid Chromatography- Evaporative Light Scattering Detector). Inoltre, tramite un'analisi ad ampio spettro 1H-HRMAS-NMR (High Resolution Magic Angle Spinning- Nuclear Magnetic Resonance) sono stati rilevati i cambiamenti relativi a più classi metaboliche contemporaneamente. Nella fase iniziale e in quella conclusiva di questo lavoro, l'integrazione delle analisi di espressione con un lavoro in silico ha consentito di operare nonostante la mancanza di estesi dati di sequenza in Beta vulgaris, che avrebbe rappresentato un importante limite al proseguimento dell'attività  di ricerca. Inizialmente, una ricerca sul sito BvGI database (TIGR, Beta vulgaris Gene Index) ha fornito le sequenze Tentative Consensus (TC), ovvero trascritti virtuali ad alta fedeltà, relative a funzioni geniche di nostro interesse per le quali non è nota la sequenza genica completa. Sulla base di queste sequenze sono stati costruiti 19 saggi utilizzati per le indagine real-time PCR successive. A seguito dell'analisi cDNA-AFLP, è stato, inoltre, possibile attribuire a TDFs a funzione sconosciuta una collocazione sui TCs disponibili in banca dati per i quali, nella maggior parte dei casi, è stato possibile predire un'annotazione funzionale. Complessivamente, i risultati ottenuti indicano che la barbabietola da zucchero sottoposta alle basse temperature subisce dei profondi cambiamenti a livello di espressione genica, che coinvolgono prevalentemente la fotosintesi, il metabolismo dei carboidrati e il metabolismo degli amminoacidi. In alcuni casi, tali variazioni possono risultare fissate nel tempo, come per la fruttosio 1,6 bifosfatasi, ma non si riflettono, almeno apparentemente, su significative variazioni nel contenuto di carboidrati. Al contrario, il metabolismo degli amminoacidi sembra invece coinvolto sia a livello di trascritti sia a livello di metaboliti. Oltre che migliorare la conoscenza molecolare della risposta della barbabietola da zucchero a stress abiotici e rendere possibile un suo confronto con la specie modello Arabidopsis thaliana, l'analisi di trascritti genici modulati da stress osmotici consentirà  di individuare gli eventuali geni correlabili con una maggiore adattabilità  o resistenza, che a loro volta potrebbero risultare un valido strumento d'identificazione precoce, tramite selezione assistita da marcatori (MAS), durante il breeding per il miglioramento genetico varietale. Questo potrebbe consentire l'ottenimento di sensibili aumenti qualitativi e produttivi con ridotto impiego di tempi e costi.