Activation phenotypes of human monocyte-derived macrophages: methodological approaches and pharmacological modulation by curcumin analogues

In condizioni normali i macrofagi sono i responsabili della risposta immunitaria e della difesa dell’ospite per mantenere l’omeostasi tissutale. In seguito a stimoli presenti nel microambiente, i macrofagi possono attivarsi, andando incontro a uno switch morfologico e funzionale. L’attivazione di queste cellule non è un processo “tutto o nulla” ma piuttosto un continuum caratterizzato da un ampio spettro di fenotipi molecolari e funzionali, i cui estremi sono rappresentati dal fenotipo definito “classico” o M1, con un profilo pro-infiammatorio, e da quello “alternativo” o M2, anti-infiammatorio e protettivo. La possibilità di promuovere un fenotipo macrofagico protettivo sta diventando un obiettivo terapeutico nel trattamento delle condizioni infiammatorie e l’identificazione di fattori che regolano l’attivazione cellulare è attualmente un’area di ricerca molto attiva. La maggior parte degli studi in questo ambito sono stati condotti utilizzando culture primarie di macrofagi di topo o linee cellulari; inoltre, i vari laboratori usano protocolli diversi di isolamento/differenziamento dei monociti e marcatori diversi di attivazione. Inoltre, il controllo farmacologico dell’attivazione macrofagica non è ancora stato indagato sufficientemente. Una serie di composti naturali e sintetici, ad esempio il calcone e la curcumina, il principale componente attivo della Curcuma longa (pianta nota per effetti anti-ossidanti, anti-microbici, anti-tumorali e anti-infiammatori) hanno dimostrato un effetto sulla funzione dei macrofagi, agendo attraverso diversi meccanismi farmacologici, ad esempio interferendo con il signaling del TLR4. Sulla base di queste premesse, gli scopi specifici di questo lavoro di tesi erano: a) testare un modello cellulare e un protocollo di differenziamento diverso da quello spontaneo, in particolare la linea cellulare monocitaria THP-1 e il differenziamento in presenza di CSF-1; b) determinare il profilo delle citochine presenti nel terreno di coltura e c) determinare la modulazione dei marcatori dei fenotipi di attivazione da parte di agenti farmacologici, in particolare da derivati di sintesi della curcumina, noti per la loro capacità di modulare l’attivazione di cellule murine di microglia attraverso la riduzione della produzione e rilascio di mediatori pro-infiammatori. I macrofagi sono stati differenziati a partire dai linfo-monociti umani isolati tramite gradiente di densità e coltivati in terreno RPMI + 10% FBS con aggiunta di CSF-1 per 6 giorni, ottenendo così macrofagi in condizioni basali (M0). Il fenotipo classico (M1) e il fenotipo alternativo (M2) sono stati ottenuti incubando i macrofagi M0 rispettivamente con 0.1-1 μg/ml LPS e IL-4 20 ng/ml + IL-13 5 ng/ml, in presenza o assenza di analoghi della curcumina, desametazone o CLI095, un inibitore del dominio intracellulare del TLR4 (questi ultimi utilizzati come composti di riferimento). I fenotipi macrofagici sono stati determinati tramite citofluorimetria utilizzando specifici anticorpi legati a fluorofori. L’espressione genica è stata valutata tramite qRT-PCR. La composizione dei terreni condizionati (macrophage conditioned media, MCM) è stata valutata con la tecnologia Luminex. Gli analoghi della curcumina sono stati gentilmente forniti dalla Prof.ssa Federica Belluti (Università di Bologna). In seguito a polarizzazione per 24 h con IL-4/IL-13 abbiamo osservato un aumento dell’espressione dei marcatori M2 rispetto a M0. Per quanto riguarda l’espressione genica di macrofagi differenziati con CSF-1, come atteso, i macrofagi M1 dopo 6 o 48h presentavano livelli superiori di mRNA per TNF-α e IL-1β rispetto a M0. L’aumento dell’mRNA era più marcato dopo 48 h per tutti i geni tranne TNF-α, che raggiungeva il picco a 6h. L’mRNA della citochina anti-infiammatoria IL-10 inaspettatamente era più espresso nei macrofagi M1 rispetto a M2 e raggiungeva il picco dopo 6 h. Rispetto a M0, l’MCM M2 era caratterizzato da alti livelli di citochine anti-infiammatorie tra le quali CCL22 e IL-4. Al contrario, l’MCM M1 presentava livelli elevati di IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, VEGF e TNF-α. Il pre-trattamento con l’analogo della curcumina GG9 e il controllo positivo CLI095 ha prevenuto l’aumento indotto da LPS del marcatore M1 CD80. Un effetto simile è mantenuto anche sulla frazione di cellule a doppia marcatura CD80+/CCR2+. Al contrario del desametazone, che aumenta la percentuale di cellule CD163+ (M2), il GG9 non ha modulato i marcatori M2. Il trattamento con GG9 ha bloccato in maniera significativa la produzione di IL-1β valutata come citochina cell-bound, nel lisato cellulare o rilasciata nel terreno di coltura. Al contrario, l’analogo GG6 non ha modificato i livelli di IL-1β intra- ed extra-cellulare. Per indagare più nel dettaglio le vie di segnale coinvolte nell’attivazione di queste cellule, abbiamo effettuato analisi Western Blot di fattori coinvolti nella via di segnale di NF-κB. L’attivazione con LPS ha ridotto significativamente l’espressione relativa di IκB-α. Curcumina, GG6 e CLI095 hanno riportato IκB-α ai livelli di controllo, a differenza del GG9 che non modificava significativamente l’espressione di questa proteina. Pertanto, i macrofagi M1 ed M2 presentano specifici profili di attivazione genica e di marcatori di superficie che possono essere modulati in seguito a trattamento farmacologico con desametazone o analoghi della curcumina. Nel complesso, questi dati suggeriscono che protocolli di attivazione macrofagica possono avere un impatto sullo stato funzionale di queste cellule e sono fondamentali per definire nuove strategie di targeting farmacologico nei macrofagi umani.