Molecular Mechanisms of Recognition of Coagulation Factors (Meccanismi Molecolari di Riconoscimento dei Fattori della Coagulazione)

I processi biochimici che sorreggono gli organismi viventi, tradizionalmente considerati come sistemi chiusi e indipendenti, sono in realtà estensivamente collegati da interazioni proteiche non canoniche in gran parte non ancora individuate. Minimi squilibri in questo network finemente regolato possono scaturire in svariate manifestazioni patologiche. Il processo di difesa che si innesca a seguito di lesioni alle pareti vascolari, denominato emostasi (Capitolo 1), si articola nell’attivazione a catena dei fattori della coagulazione, con la generazione di un coagulo localizzato al sito di danno. La reazione centrale della cascata della coagulazione è l’attivazione della protrombina ad a-trombina da parte del FXa, attraverso la generazione dell’intermedio pretrombina-2, fisiologicamente rilevante. L’a-trombina matura è una proteina ellissoidale, composta da due b-barrel a sei filamenti che circoscrivono, alla loro interfaccia, la triade catalitica carica negativamente (His57, Asp102, Sar195). Ai lati del sito attivo, in due regioni diametralmente opposte, sono situate due siti carichi positivamente, denominati esosito I ed esosito II. Queste due extra superfici di riconoscimento mediano l’interazione con diversi substrati e ligandi fisiologici. L’a-trombina gioca un ruolo chiave nella regolazione dell’emostasi, svolgendo sia funzioni procoagulanti (aggregazione piastrinica, generazione di fibrina) che paradossalmente anticoagulanti (attivazione della proteina C). Questo enzima opera inoltre all’interfaccia tra infiammazione, proliferazione cellulare e malattie neurodegenerative. La correlazione tra a-trombina e proteine del sistema nervoso centrale è senza dubbio un ambito di studi innovativo (Capitolo 2.1). Quando presente ad alte concentrazioni cerebrali l’a-trombina innesca uno stato pro-infiammatorio nel cervello, potenzialmente coinvolto nell’insorgenza di malattie neurodegenerative. In particolare, il termine sinucleinopatie è riferito a un insieme di patologie (fra tutte il morbo di Parkinson) in cui aggregati proteici intracellulari, composti principalmente di a-sinucleina, si accumulano a livello di neuroni e cellule della glia. L’a-sinucleina è un’abbondante proteina presinaptica appartenente alla famiglia delle NUPs (naturally unfolded proteins), la cui funzione fisiologica è tuttora oggetto di dibattito. Sorprendentemente, questa proteina altamente conservata è stata rilevata anche nel plasma e a livello delle cellule ematopoietiche, in particolar modo nelle piastrine. Studi clinici dimostrano che i pazienti affetti da morbo di Parkinson, caratterizzati da elevate concentrazioni di a-sinucleina, presentano minori attacchi ischemici, dovuti a ridotta aggregazione piastrinica. Poiché le piastrine rappresentano il bersaglio cellulare per eccellenza dell’a-trombina, abbiamo orientato il nostro lavoro nello studio dell’interazione tra questo enzima e l’a-sinucleina (Capitolo 2.2). I nostri dati sperimentali dimostrano chiaramente che i due partner interagiscono in un complesso binario in cui l’a-sinucleina lega entrambi gli esositi dell’a-trombina, con la sua estremità C-terminale carica negativamente. La costante di affinità, fisiologicamente rilevante nel microambiente concentrato che circonda la superficie piastrinica, giustificherebbe lo scavenging da parte dell’a-sinucleina dei processi di iper-aggregazione. In questa intricata rete di collegamenti, il feedback positivo tra coagulazione e infiammazione è stato ampiamente descritto (Capitolo 3.1). Durante i fenomeni di setticemia, la risposta infiammatoria viene costitutivamente attivata nel tentativo di combattere un agente patogeno esterno. Questa condizione degenera in uno stato pro-infiammatorio distruttivo per l’ospite stesso, spesso accoppiato a fenomeni di coagulazione disseminata intravascolare. In questo scenario, le proteasi secrete da organismi esogeni potrebbero giocare un ruolo rilevante durante le prima fasi dell’infezione attraverso l’attivazione diretta della cascata coagulativa. Svariati microorganismi patogeni esprimono e secernono proteasi subtilisin-like (famiglia delle subtilasi), caratterizzate da un’ampia aspecificità di taglio. Ci siamo quindi focalizzati nello studio della proteolisi degli zimogeni inattivi dell’a-trombina umana, pretrombina-2 (Capitolo 3.2) e protrombina (Capitolo 3.3), da parte delle subtilasi di origine batterica. In particolare, la subtilisina Carlsberg, ampiamente caratterizzata e commercialmente disponibile, è stata utilizzata come prototipo di tutta la superfamiglia. A partire dai dati sperimentali di proteolisi e attività enzimatica è emerso che la subtilisina attiva entrambi gli zimogeni a una nuova specie trombino-simile, attraverso l’idrolisi del legame peptidico Ala470(149a)-Asn471(149b). La nuova specie attiva, denominata sPre2, è un complesso non covalente, caratterizzato dalla stessa specificità di idrolisi dell’a-trombina, con un’efficienza catalitica ≈150 volte inferiore all’enzima wild type. Dalla mappatura eseguita mediante saggi di fluorescenza e risonanza plasmonica di superficie è emerso che la sPre2 è caratterizzata da un esosito II perfettamente formato, un esosito I imperfetto e da un sito attivo correttamente formato, che tuttavia presenta dei deficit nel processo di conversione dei substrati fisiologici dell’a-trombina in prodotti. Sia i dati clinici che le evidenze sperimentali dimostrano l’importanza cruciale del mantenimento dell’omeostasi nella coagulazione, che, in condizioni fisiologiche, è leggermente sbilanciata verso uno stato emorragico, per mantenere la fluidità del sangue nei vasi sanguigni intatti. Una rottura di questo equilibrio dovuto a un aumento di funzionalità porta a manifestazioni patologiche genericamente riferite come trombosi (Capitolo 4.1). Sfortunatamente, la terapia anticoagulante classica presenta limitazioni ed effetti collaterali di sanguinamento ben documentati. Negli ultimi anni, un nuovo trend di ricerca è rappresentato dall’ingegnerizzazione di anticoagulanti naturali da organismi ematofagi. Tra tutti, l’anticoagulante irudina, originariamente estratto dalle sanguisughe medicinali, è il composto più popolare, essendo l’inibitore dell’a-trombina più potente e specifico in natura. In questo lavoro di Tesi proponiamo una nuova strategia di produzione dell’irudina ricombinante, attraverso la coniugazione a SUMO (small ubiquitin-like modifier protein), una proteina chaperone eucariotica, coadiuvante nel folding e nella solubilizzazione proteica (Capitolo 4.2). L’irudina ricombinante prodotta con questa strategia è caratterizzata dalle stesse proprietà spettroscopiche e attività inibitoria della variante naturale. In conclusione, la coagulazione è senza dubbio uno dei sistemi fisio-patologici più affascinanti e articolati, presentando diverse connessioni con differenti pathway biochimici. I meccanismi molecolari di riconoscimento dei fattori della coagulazione nell’interazione con proteine tradizionali o alternative è un argomento ancora largamente inesplorato.