Study of mechanism of action of the phototoxicity of drugs and of new natural compounds endowed with antiproliferative activity

Studio del meccanismo d’azione della fototossicità di farmaci e di nuovi composti naturali ad azione antiproliferativa. Negli ultimi anni è stato osservato un aumento di casi clinici riguardanti la fototossicità dei farmaci, e questo fatto probabilmente è dovuto a cambiamenti di stile di vita e a un maggior numero di farmaci presenti sul mercato. In questo studio sono stati esaminati i meccanismi di fototossicità di due farmaci inibitori della HMG-CoA riduttasi: la Fluvastatina e la Pitavastatina. Inizialmente è stato osservato che questi farmaci in soluzione acquosa, sono in grado di formare dei fotoprodotti, in seguito ad irradiazione con raggi UVA. Questi fotoprodotti sono stati separati attraverso HPLC e caratterizzati mediante spettrometria di massa e NMR. Per quanto riguarda la fluvastatina è stato isolato un fotoprodotto (FP6) in quantità sufficiente, mentre per la pitavastatina sono stati isolati due fotoprodotti (PP3 e PP4). La fototossicità di questi farmaci e dei loro fotoprodotti, è stata testata su una linea di cheratinociti umani NCTC-2544. La fototossicità cellulare è stata valutata attraverso il test del MTT dopo 72 ore dall’irradiazione, in presenza dei due farmaci e dei loro fotoprodotti sottoposti a diverse dosi di UVA. I risultati ottenuti mostrano una riduzione della vitalità cellulare dipendente dalla dose di UVA somministratisi e dalla concentrazione utilizzata e in maniera interessante è stato notato che i fotoprodotti risultano essere molto più fototossici del farmaco di partenza. Successivamente grazie all’uso della citometria a flusso, è stato dimostrato che questi farmaci e i loro fotoprodotti sono in grado di indurre necrosi come meccanismo principale di morte cellulare, come risulta dalla rapida incorporazione di ioduro di propidio nelle cellule irradiate in presenza dei composti in esame. Ciò è stato inoltre confermato anche da una forte deplezione dei livelli cellulari di ATP senza che vi sia alcuna depolarizzazione del potenziale mitocondriale. Ulteriori studi hanno mostrato un incremento di calcio a livello citoplasmatico dovuto a un ingresso di calcio extracellulare causato probabilmente da danni indotti alla membrana cellulare in seguito all’insulto fototossico. A conferma di questa ipotesi abbiamo osservato dopo trattamento un elevato livello di perossidazione dei lipidi di membrana. Questi dati suggeriscono che questi farmaci attraverso la formazione di fotoprodotti e/o specie reattive (radicali ROS) presentano come bersaglio la membrana cellulare sulla quale esercitano i loro effetti fototossici. Un altra ricerca svolta in questo dottorato ha riguardato lo studio di composti naturali come antitumorali. Le sostanze presenti in natura sono da secoli conosciute per le loro proprietà curative e negli ultimi anni sono divenuti molto importanti per la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci infatti molti di essi hanno origine naturale. I composti valutati sono stati isolati dalla Ferula, dalla ferula communis, ferulago campestris e dalla ferula glauca, una pianta facente parte della famiglia delle Umbrellifere. Queste piante sono state molto studiate per la loro attività antimicrobica estrogenica, antivirale e con proprietà citotossiche, in vitro antilesmanica e antiproliferativa. Inizialmente è stata valutata la citotossicità dei diversi composti su sei linee cellulari: 3 linee provenienti da tumori solidi e 3 linee leucemiche. Da questo screening sono stati individuati quattro composti strutturalmente correlati a Daucano Esteri che presentano una buona attività citotossica elevata attività citotossica soprattutto sulle linee leucemiche. Successivamente è stata analizzata l’attività dei quattro composti sul ciclo cellulare e la loro attività proapoptotica Di questi quattro composti tutti hanno mostrato un blocco del ciclo cellulare in fase G1 ma solo due presentano un’ elevata attività proapototica così si è proceduto allo studio approfondito solo di due composti denominati DE-8 e DE-11. E’ stata valutata la produzione di ROS (Reactive Oxygen Species) ed è stato esaminato il potenziale mitocondriale, andando così ad osservare che già dopo 1h dall’incubazione con il composto si aveva un elevata produzione di ROS mentre la depolarizzazione del potenziale mitocondriale avveniva successivamente , a tempi più lunghi, indicando che la produzione di ROS era dovuta alla molecola in se e non come conseguenza della depolarizzazione mitocondriale. Per confermare che la morte cellulare avveniva per la produzione precoce di ROS le cellule sono state incubate con scavenger dei ROS quali N-acetilcisteina, Tocoferolo e Butilidrossianisolo. I risultati ottenuti hanno dimostrato un significativo aumento della sopravvivenza cellulare delle cellule trattate con DE-8 insieme ad inibitori dei ROS rispetto alle cellule trattate solo con il composto. Successivamente le cellule sono state incubate anche con un inibitore pancaspasico, lo Z-Vad, dimostrando anche in questo caso un aumento della vitalità cellulare, suggerendo che l’apoptosi è caspasi dipendente