NMR and biochemical analysis of protein-protein interactions: insights on dopamine synthesis regulation and heterochromatin formation

Il riconoscimento molecolare tra proteine riveste un ruolo fondamentale nella gran parte dei processi biologici. Pertanto, la caratterizzazione strutturale delle interazioni proteina-proteina rappresenta una chiave di lettura fondamentale per far luce sui meccanismi molecolari alla base dei processi biologici. Inoltre tale caratterizzazione può chiarire le basi strutturali della funzione di quelle proteine che mancano di attività catalitica rilevabile. La regolazione della sintesi di dopamina è un esempio dell'importanza delle interazioni proteina-proteina nella modulazione delle funzioni biologiche. La dopamina, uno dei neurotrasmettitori catecolamminergici, regola molte funzioni del sistema nervoso, tra cui quelle legate al comportamento ed ai processi cognitivi, all’attività motoria e al sonno. L'enzima responsabile della sintesi del suo precursore L-DOPA, è la Tirosina Idrossilasi. Data l’importanza della sua attività catalitica, l’enzima è finemente regolato da molteplici meccanismi. Uno dei più importanti è basato sull’interazione con modulatori proteici. Le proteine 14-3-3 legano il dominio regolatore ammino-terminale della Tirosina Idrossilasi, stabilizzandone la conformazione cataliticamente attiva. Diversi dati pubblicati in letteratura sostengono che anche l’alfa-sinucleina, una proteina “natively unfolded” correlata all’insorgenza del morbo di Parkinson, potrebbe avere una funzione nella sintesi della dopamina, attraverso l'inibizione della Tirosina Idrossilasi. Di particolare interesse sono le evidenze sperimentali che dimostrano l'interazione tra alfa-sinucleina e proteine 14-3-3, che potrebbe giocare un ruolo importante nella complessa rete di regolazione della sintesi della dopamina. La prima parte di questa ricerca è focalizzata sulla caratterizzazione delle interazioni fra i tre modulatori proteici della sintesi della dopamina, attraverso l’utilizzo combinato di tecniche biochimiche e spettroscopiche. Il lavoro si articola in più livelli. Metodi di biologia molecolare, biochimica e spettroscopia sono stati impiegati per produrre e caratterizzare i campioni di proteine per i successivi studi. Abbiamo poi analizzato l'interazione di ciascuna coppia di proteine, utilizzando sia tecniche di biochimica e di biofisica, in particolare spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Dai risultati elettroforetici e cromatografici è emerso che alfa-sinucleina e proteine 14-3-3 non formano un complesso stabile in soluzione, mentre esperimenti NMR suggeriscono che vi sia una interazione debole che coinvolge solo i primi residui della regione ammino-terminale dell' alfa-sinucleina. Tuttavia, esperimenti di aggregazione seguendo il segnale di polarizzazione di fluorescenza, portano ad una forte indicazione dell’interazione tra le due proteine, dimostrando che le proteine 14-3-3 sono in grado di rallentare la velocità di aggregazione dell’alfa-sinucleina. Complessivamente i risultati suggeriscono che le proteine 14-3-3 potrebbero legarsi alle specie oligomeriche dell' alfa-sinucleina, aprendo quindi la strada ad una possibile funzione di “chaperon” nell’ inibizione del processo di aggregazione e fibrillazione dell’ alfa-sinucleina. Invece, sia gli studi di attività enzimatica che NMR, indicano che l’ alfa-sinucleina non è un inibitore della Tirosina Idrossilasi, e che non c’è interazione diretta tra le due proteine nelle condizioni sperimentali utilizzate. Infine, mediante tecniche biochimiche, abbiamo verificato che le proteine 14-3-3 e Tirosina Idrossilasi fosforilata sulla serina 19, formano un complesso ad alta affinità. Abbiamo quindi purificato il complesso su larga scala, ed effettuato lo screening preliminare di cristallizzazione. La seconda parte del lavoro di ricerca si occupa dell’ indagine strutturale, mediante NMR, di un secondo esempio di interazione proteina-proteina che è alla base di una differente funzione biologica. Abbiamo analizzato il meccanismo di riconoscimento molecolare tra “Heterochromatin protein 1” (Hp1beta) ed un peptide di ventuno residui che mima la regione ammino-terminale della proteina istonica, appartenente al complesso proteico nucleosoma. L’interazione tra Hp1beta e l’istone III porta all’impacchettamento del DNA in strutture terziarie e quaternarie, definite complessivamente eterocromatina. Dal momento che l’eterocromatina impedisce l'accesso dell’apparato di trascrizione al DNA, la sua formazione rappresenta un meccanismo di regolazione per inibire l'espressione genica in specifiche regioni del genoma. Il requisito fondamentale per studiare questa interazione mediante NMR, è l’assegnazione, utilizzando esperimenti tridimensionali eteronucleari, delle risonanze di 1H, 15N e 13C della catena polipeptidica della proteina Hp1beta. Ad oggi abbiamo completato l’assegnazione dei segnali relativi al dominio che media l’interazione con la proteina istonica III, definito “chromo-domain”. L'assegnazione dei segnali relativi alle altre due regioni della molecola, definiti “hinge-region” e “chromo-shadow domain”, è tuttora in corso. Abbiamo poi caratterizzato le proprietà di “tumbling” delle diverse regioni della proteina Hp1beta, mediante particolari esperimenti di rilassamento di magnetizzazione, definiti di “cross-correlation”. I valori di “residual dipolar coupling” sono stati utilizzati per confrontare la struttura del “chromo-domain” compreso nella proteina intera, con la struttura pubblicata dello stesso dominio prodotto come mutante di delezione. Tramite esperimenti di titolazione per risonanza magnetica nucleare abbiamo infine individuato i residui amminoacidici della proteina Hp1beta che sono coinvolti nel riconoscimento molecolare del peptide. I risultati dell’analisi delle differenze nei valori di “chemical shift”, ha consentito di mappare le regioni della proteina Hp1beta che sono coinvolte nell'interazione con la parte ammino-terminale dell'istone III.