Microenviroment modulation on plasticity of Enteric Nervous System derived cells

E’ noto che i fattori di crescita quali EGF, bFGF e GDNF giocano un ruolo essenziale nello sviluppo e nell’omeostasi del sistema nervoso enterico (SNE). Condizioni in vivo che prevedono un calo o un’assenza del loro apporto, favoriscono lo sviluppo di patologie quali agangliosi intestinale. In questo lavoro di tesi, allestendo due modelli di coltura in vitro che simulano la condizione fisiologica (SM) e quella di agangliosi (BM) mediante coltura in presenza (SM) o meno di fattori di crescita (BM) è stata oggetto di studio la risposta differenziativa di cellule isolate da plesso mienterico di ratto Sprague Dawley (ENSc) [Schaefer et al., 1997]. In particolare, veniva prestata attenzione ai meccanismi di regolazione della risposta cellulare mediata dal segnale TLR4 e Wnt. Lo studio di caratterizzazione dell’immunofenotipo mediante citofluorimetria evidenziava nelle popolazioni estratte l’espressione di marcatori di staminalità (SOX2, Nanog e CD34) e di linea neuronale e gliale (p75, Nestina, GFAP). Inoltre, si evidenziava la presenza di una sottopolazione con caratteristiche neuronali che co-esprimeva i recettori TLR4 e Frizzled-9, suggerendo un ruolo nella regolazione del processo infiammatorio. La coltura in terreno SM e BM dimostrava di modulare in maniera specifica il differenziamento neuronale e gliale delle ENSc e di conferire una maggiore reattività mediata dal Frizzled 9 (coltura SM) e dal TLR4 (coltura BM). Inoltre, l’analisi di microscopia ottica evidenziava la formazione di strutture del tipo neurosfere solo nelle colture trattate con terreno standard. Lo stimolo indotto dal Wnt3a risultava efficace nell’attivare la via di segnale canonica di Wnt attraverso il recettore Frizzled 9 e, all’analisi di espressione genica mediante qRT-PCR, dimostrava un’attività di tipo anti-infiammatorio. Inoltre, mediante uno studio di western blotting, si dimostrava che la via pro-infiammatoria del TLR4 cross-reagiva con il segnale Wnt attivandolo. E’ noto che il processo differenziativo è fortemente condizionato dalla matrice extracellulare. In questo studio l’effetto modulatorio indotto dalla matrice sulla risposta differenziativa delle cellule ENSc è stato valutato utilizzando matrice acellularizzata (AM) di tessuto intestinale di ratto. La preparazione dello scaffold ha previsto 5 cicli ripetuti di decellularizzazione del trattamento modificato detergente enzimatico di Meezan [1975]. La completa decellularizzazione del tessuto veniva verificata mediante studio istologico, analisi di microscopia elettronica a scansione (SEM) e quantificazione del contenuto di DNA residuo. All’analisi di immunofluorescenza e western blotting, le proteine strutturali quali collagene I, III, IV e laminina risultavano preservate al termine della decellularizzazione. Dopo coltura per 7, 14 giorni delle cellule ENSc sulla matrice, AM dimostrava di condizionare l’organizzazione spaziale delle cellule ENSc esercitando un effetto specifico differenziativo in sinergia con i fattori di crescita. Infatti, solo le matrici mantenute in terreno SM mostravano una caratteristica organizzazione delle cellule ENSc in strutture interconnesse di tipo simil-gangliare esprimenti il marcatore neuronale βIII tubulina. Le colture di ENSc su matrice acellulare possono rappresentare un valido modello in vitro per studi tossicologici ed un possibile sostituto tessutale nella medicina rigenerativa.